新鲜兔肝或鸡肝中DNA的制备提取检测方案(氮吹仪)

来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 动物组织 DNA的制备 一、实验原理 提取核酸的基本程序包括细胞破碎-解聚核蛋白并去除蛋白质-沉淀核酸并去除其它杂质三步。破碎细胞的方法很多，高等动植物材料常用液氮研磨法。 核蛋白利用 DNA核蛋白在 0.14mol/L Nacl 盐溶液的溶解度很低的特点而实验其与 RNA核蛋白分离，残存的RNA经 R Nase 水解而去除。 蛋白质经蛋白酶水解，并经苯酚、氯仿变性而分开。提纯过程中的 DNA 酶活性经低温操作并用SDS解聚或柠檬酸三钠和 EDTA·Na2 等螯合剂抑制。逐渐纯化的 DNA 经乙醇或异丙 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 景盛南二街33号4号楼4层 醇沉淀而收集，最终实现 DNA分离纯化之目的。 二、实验用品 (一)器材 (1)离心机。 (2)水浴锅。 (3)紫外分光光度计。 (4)研本、液氮、带盖离心管。 (二)试剂 (1)蛋白酶K：用水或 TEN9 溶液溶解成10mg/ml， 或直接用粉末。 (2) TEN9 pH9.0：称取 Tris6.05g EDTANa237.224g和NaCL 11.688g 按顺序溶于蒸馏水中，以HCL调 PH9.0。 (3) TE 溶液： 50mmol/L Tris.HCL(PH8.0)-10mmol/L EDTANa2(PH8.0) (4) SS-phenol：以 Tris 平衡重蒸酚至 PH8.0， 加入0.1%的8-羟基喹啉(使溶液呈黄色，防止酚的氧化) 。 (5)1mmol/L Tris.HCL(PH8.0)： Tris121.14g 溶解于蒸馏水中，以HCL调PH至8.0定容至1L。 (6)20% SDS：20g SDS 溶于100ml蒸馏水中，配制时要小心， SDS 对呼吸道有强烈的刺激，且毒性较大。 (7) RNase A 若试剂含有痕量 DNase， 用前100℃ 10min灭活 DNase。 (8) 3mol/L NaAc，pH6.5：称取 NaAc3H2O408.1g 溶于蒸馏水中， HAc调PH至6.5 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 后定容至1L。 TEN9、Tris.HCL、NaAc 均需高压灭菌。 (三)材料 新鲜兔肝或鸡肝。 二、实验程序 (一)操作方法 1.操作步聚 (1)在液氮存在的条件下，于研中将5g动物组织碾成细粉(约需20~30min)。 (2)待液氮挥发后，将细粉转至 50ml 带盖的离心管中，加入20mlTEN9和 RNase(100ug/ml)，混合均匀，加入1ml 20%SDS， 将离心管上下颠倒几次，并继续轻摇10min. (3)加入10mg蛋白酶K粉末，慢速搅拌使之溶解并混匀。 (4)在37℃至55℃保温2~4小时，其间不时批轻摇。 (5)如需要，再加入10mg蛋白酶K粉末，继续保温至少2h，使组织充分消解。 (6)加入20ml SS-phenol，温和颠倒离心管，使两相充分混合，形成类似乳浊液状。 (7)室温， 10000r/min 离心 10min，使混合液清晰分相(如分层不明显，可适当加大离心力及离心时间)。上层水相含 DNA， 中间为变性蛋白质，下层为酚相。 (8)用大口吸管将上层水相转至另一只离心管中，弃去界面相和酚相。 (9)将第6~8步重复进行几次，直至中间相完全消失(蛋白质必须去除干净，否则对 DNA 的溶解及酚切都不利)。 (10)离心后，将水相转到透析袋中以去除小分子物质。在 TE 中透析(稀释因数应大于1000，稀释因数指外界溶解与待透析液体积比的累积乘积)，并用磁力搅拌器搅拌，提高透析效率，2h后转至4℃继续透析4h 或过液(开始时，溶液中含大量的 SDS， 低温下易析出，因此开始时必须先在温室透析，由于透析袋较昂贵，用后可用 TE 浸泡， 煮沸10min，可续用)，可静止透析。 (11)将透析后的溶液转至50ml离心管中，加入 NaAc 溶液，使其终浓度为 0.3mol/L，再加入0.8体积的异丙醇，温和混匀(亦可用2倍体积的乙醇代替异丙醇，但可能使沉淀体积过大)。 (12)用玻璃棒绕起或钩出呈现纤维状的 DNA， 由于异丙醇不易干燥，可用70%的乙醇快速冲洗干燥后， 在2~5ml TE中完全溶解，并置冰箱保存。 (13)测定此 DNA 溶液在260nm 和280nm 波长下的OD 值，此值应大于1.7.如果小于1.7，则说明含较多的蛋白，需加少量蛋白酶K保温后，用SS-酚进一步抽提。另外， 235nm处为盐类及小分子化合物的吸收峰，因此应大于1.7。 2得率的计算 由于 10D260的 DNA 浓度为 50ug/ml， 因此 DNA 得率可按下公式计算：1g新鲜组织的 DNA 含量=OD260x50×溶解体积/组织鲜重(ugDNA/g)。 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) ( 技术中心：北京金桥科技产业基地 ) 景盛南二街33号4号楼4层 北京来亨科学仪器有限公司技术中心：北京金桥科技产业基地 京来亨科学仪器有限公司技术中心：北京金桥科技产业基地景盛南街楼层   一、实验原理提取核酸的基本程序包括细胞破碎-解聚核蛋白并去除蛋白质-沉淀核酸并去除其它杂质三步。破碎细胞的方法很多，高等动植物材料常用液氮研磨法。 核蛋白利用DNA核蛋白在0.14mol/L Nacl盐溶液的溶解度很低的特点而实验其与RNA核蛋白分离，残存的RNA经 R Nase水解而去除。 蛋白质经蛋白酶水解，并经苯酚、Trichloromethane变性而分开。提纯过程中的DNA酶活性经低温操作并用SDS解聚或柠檬酸三钠和EDTA.Na2等螯合剂抑制。逐渐纯化的DNA经乙醇或异丙醇沉淀而收集，最终实现DNA分离纯化之目的。 二、实验用品  （一）器材（1）离心机。（2）水浴锅。（3）紫外分光光度计。（4）研钵、液氮、带盖离心管。（二）试剂  （1）蛋白酶K:用水或TEN9溶液溶解成10mg/ml，或直接用粉末。（2）TEN9 pH9.0:称取Tris6.05g EDTA.Na237.224g和NaCL 11.688g按顺序溶于蒸馏水中，以HCL调PH9.0。（3）TE溶液：50mmol/L Tris.HCL(PH8.0)-10mmol/L EDTA.Na2(PH8.0)。（4）SS-phenol:以Tris平衡重蒸酚至PH8.0，加入0.1%的8-羟基喹啉（使溶液呈黄色，防止酚的氧化）。（5）1mmol/L Tris.HCL(PH8.0)：Tris121.14g溶解于蒸馏水中，以HCL调PH至8.0定容至1L。（6）20% SDS:20g SDS溶于100ml蒸馏水中，配制时要小心，SDS对呼吸道有强烈的刺激，且毒性较大。（7）RNase A 若试剂含有痕量DNase，用前100℃ 10min灭活DNase。（8）3mol/L NaAc,pH6.5:称取NaAc.3H2O408.1g溶于蒸馏水中，HAc调PH至6.5后定容至1L。   TEN9、 Tris.HCL、NaAc均需高压灭菌。 （三）材料    新鲜兔肝或鸡肝。 二、实验程序（一）操作方法 1.操作步聚 （1）在液氮存在的条件下，于研中将5g动物组织碾成细粉（约需20~30min）。 （2）待液氮挥发后，将细粉转至50ml带盖的离心管中，加入20mlTEN9和RNase(100µg/ml),混合均匀，加入1ml 20%SDS，将离心管上下颠倒几次，并继续轻揺10min。（3）加入10mg蛋白酶K粉末，慢速搅拌使之溶解并混匀。（4）在37℃至55 ℃保温2~4小时，其间不时地轻摇。（5）如需要，再加入10mg蛋白酶K粉末，继续保温至少2h，使组织充分消解。（6）加入20ml SS-phenol,温和颠倒离心管，使两相充分混合，形成类似乳浊液状。（7）室温，10000r/min离心10min，使混合液清晰分相（如分层不明显，可适当加大离心力及离心时间）。上层水相含DNA，中间为变性蛋白质，下层为酚相。（8）用大口吸管将上层水相转至另一只离心管中，弃去界面相和酚相。（9）将第6~8步重复进行几次，直至中间相完全消失（蛋白质必须去除干净，否则对DNA的溶解及酚切都不利）。(10)离心后，将水相转到透析袋中以去除小分子物质。在TE中透析（稀释因数应大于1000，稀释因数指外界溶解与待透析液体积比的累积乘积），并用磁力搅拌器搅拌，提高透析效率，2h后转至4℃继续透析4h或过液（开始时，溶液中含大量的SDS，低温下易析出，因此开始时必须先在温室透析，由于透析袋较昂贵，用后可用TE浸泡，煮沸10min,可续用），可静止透析。（11）将透析后的溶液转至50ml离心管中，加入NaAc溶液，使其终浓度为0.3mol/L,再加入0.8体积的异丙醇，温和混匀（亦可用2倍体积的乙醇代替异丙醇，但可能使沉淀体积过大）。（12）用玻璃棒绕起或钩出呈现纤维状的DNA，由于异丙醇不易干燥，可用70%的乙醇快速冲洗干燥后，在2~5ml TE中完全溶解，并置冰箱保存。（13）测定此DNA溶液在260nm和280nm波长下的OD值，此值应大于1.7.如果小于1.7，则说明含较多的蛋白，需加少量蛋白酶K保温后，用SS-酚进一步抽提。另外，235nm处为盐类及小分子化合物的吸收峰，因此应大于1.7。 2得率的计算由于1OD260的DNA浓度为50µg/ml，因此DNA得率可按下公式计算：1g新鲜组织的DNA含量=OD260×50×溶解体积/组织鲜重（µg DNA/g）。