电泳纯的蛋白质（牛清白蛋白1mg/ml）中二维图像检测方案(毛细管电泳仪)

来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 蛋白质的脲梯度电泳 红 一、实验原理 近年来，聚丙烯酰胺脲梯度电泳成为研究蛋白质去折叠与再折叠的非常重要的实验技术之一。脲梯度电泳的基本原理是在常规的聚丙烯酰胺凝胶中加入非离子型变性剂-尿素，使其形成脲浓度梯度。 电泳时将脲梯度置于垂直电泳方向，使同一蛋白质样品在连续变化的不同浓度的脲环境中电泳，蛋白质分子随脲浓度变化而发生的结构状态的变化，因而表现出不同的迁移率，最终在显色后的凝胶中呈现出反映蛋白质构象变化的二维图像。 二、实验用品 北京来亨科学仪器有限公司 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 (一)器材 (1)Bio-Rad公司垂直板型电泳装置。 (2)蠕动泵。 (3)梯度混合器、电磁搅拌器及电磁搅拌子。 (4)1ml和100pL微量进样器，注胶用的细长针管。 (二)试剂 (1)电极缓冲液的选择：缓冲液的选择取决于样品蛋白质的性质，如等电点、溶解度、稳定性和实验目的等。 (2)0~8mol/L脲梯度电泳配方。 表9-15 脲梯度电泳胶配方 试剂 A溶液 (不含脲，含15%甘油) B溶液 (含8 mol/L 脲，不含甘油) 脲 分离胶缓冲液 30%Acr-Bis 溶液50%甘油 重蒸水 0 3.75 mL 8.484g 3.75 mL 3.15 mL 0 2.65 mL 3.15mL 4.05 mL 2.65mL 0.1%核黄素 TEMED 67.5 pL 13 uL 67.5pL 13pL a.1.5 mol/L Tris·HCl缓冲液 pH8.8；b.29.2g丙烯酰胺(Acr)和0.8gN，N'-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，溶于重蒸水中，定溶到 100 mL；c.增加A溶液的粘度，用来平衡因B溶液中含有8 mol/L 脲而引起的溶液粘度的变化 (3)染色液、脱色液及保存液配制方法。 溶液名称 配制方法 染色液 考马斯亮蓝R-250 0.25g 溶于125ml甲醇和17.5ml冰醋 酸中，用蒸馏水配制到250ml。 7%醋酸-20%甲醇脱色液 甲醇100ml， 冰醋酸35ml， 加蒸留水配成500ml。 7%醋酸保存液 冰醋酸 35ml，加蒸馏水配制成500ml。 (三)材料 电泳纯的蛋白质(牛清白蛋白1mg/ml) 三、实验程序 1.连接好梯度胶灌制系统 2.制交 按表中给的数据配制A 溶液和B溶液，并灌制一块高15cm， 宽16.2cm，厚度0.1cm的胶板，脲梯度为 0~8mol/L，其总体积为27ml， 丙烯酰胺浓度T=7%，交联度 C=2.6%。事先调好蠕动泵输液流量，计算好A和B溶液的量，使A、B溶液的体积恰如所需，然后将准确配制好的A、B溶液分别加至A、B两容器中，启动搅拌子，打开A、B容器之间的二通阀，启动蠕动泵。容器A、B的混合液经由蠕动泵通过细针管，小心地输入玻璃夹层之中。 灌胶时应注意： 1.灌制时间控制在15min 左右； 2.磁力搅拌子的转速应保证容器中的液体充分混匀； 3.防止灌胶过程中任何部位的胶体外漏； 4.装置中C是长 18cm的空心针针管，灌胶时匀速提高针尖距液面的距离，以防止溶液搅拌动影响线性梯度的均匀形成。 3、电泳 当凝胶充分聚合后，将胶片旋转90度，使脲梯度垂直于泳动方向，密封夹条调换位 技术中心：北京金桥科技产业基地 置，用1%的琼脂糖填充胶底(转向前的侧面)。然后按正常电泳法处理样品并上样(上样体积100~200uL左右，蛋白含量50~100微克左右)，用恒定电流25mA电泳，当溴酚蓝色泳至距胶端5mm 左右时，停止电泳。 4.染色与脱色。 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放入大培养皿中，加入染色液染色1~2h，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 5.结果 绘制出电泳图谱，并分析脲浓度对蛋白质构象的影响。 ( 技术中心：北京金桥科技产业基地 ) 北京来亨科学仪器有限公司技术中心：北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 北京来亨科学仪器有限公司景盛南街楼层 实验原理近年来，聚丙烯酰胺脲梯度电泳成为研究蛋白质去折叠与再折叠的非常重要的实验技术之一。脲梯度电泳的基本原理是在常规的聚丙烯酰胺凝胶中加入非离子型变性剂-尿素，使其形成脲浓度梯度。 电泳时将脲梯度置于垂直电泳方向，使同一蛋白质样品在连续变化的不同浓度的脲环境中电泳，蛋白质分子随脲浓度变化而发生的结构状态的变化，因而表现出不同的迁移率，最终在显色后的凝胶中呈现出反映蛋白质构象变化的二维图像。二、实验用品  （一）器材（1）Bio-Rad公司垂直板型电泳装置。（2）蠕动泵。（3）梯度混合器、电磁搅拌器及电磁搅拌子。（4）1ml 和100µL微量进样器，注胶用的细长针管。（二）试剂  （1）电极缓冲液的选择：缓冲液的选择取决于样品蛋白质的性质，如等电点、溶解度、稳定性和实验目的等。