水稻幼苗或蚕豆幼苗和白菜嫩叶等中植物DNA检测方案(水浴、油浴)

来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 植物组织 DNA的制备 一、实验原理 植物 DNA 的制备与动物 DNA制备原理大致相同，为获得高相对分子质量 DNA，应取幼嫩组织或组织培养物为材料，常以液氮冷冻下研磨的方法破组织和细胞。 由于植物材料 DNase水平低，蛋白含量较少，其操作要求是要克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖与 DNA 共存对制备的影响。 二、实验用品 (一)器材 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 (1)冰冻高速离心机。 (2)液氮罐。 (3)台式离心机。 (4)电热恒温水浴锅。 (5)电热恒温培养箱。 (6)电冰箱，离心管和 tip。 (二)试剂 (1) 5mol/L Nacl： 称取 NaCL 146.10g用蒸馏水定容至500ml。 (2) CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液。 A.2mol/L TrisHCL 缓冲液 (pH8.0)： 24.2g Tris 溶于 80ml重蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.0，用重蒸水定容至 100ml。 B.0.5mol/L EDTA 缓冲液(PH8.0)：取186.12g EDTA.Na2 用重蒸水 800ml 溶解，然后用 NaOH 调节 pH至8.0，加重蒸水至1000ml。 (3)巯基乙醇。 (4)PVP(聚乙稀吡咯烷酮)。 (5)石英砂。 (6)氯仿：异戊醇(24：1)，现用现配。 (7)异丙醇。 (8)75%乙醇。 (9) TE 缓冲液：取5ml 2mol/L Tris-HCL 和 2ml0.5mol/L EDTNa2。用重蒸水定容至1000ml 北京来亨科学仪器有限公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 (10) RNase A： 取 100mg RNase 溶于 10ml含有 10mmol/LTris(pH7.5)-15mmol/LNacl的溶液中，于100℃加热 15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 (三)材料 水稻幼苗或蚕豆幼苗和白菜嫩叶等。 二、实验程序 (一)操作方法 1.操作步聚 (1) 在50ml离心管中加入10ml CTAB 缓冲液。 (2)取1~2g新鲜叶片(去主脉)于研钵中，加入 0.1gPVP或石英砂，在液氮中迅速研磨成粉末后，把粉末转入带 CTAB 缓冲液的离心管中，边加边搅拌半之混合均匀。 (3)于65℃水浴保温 0.5~1h。 (4)冷却至室温后，加入等体积10mlTrichloromethane 异戊醇溶液，颠倒混匀 10min。 (5)10000 r/min 离心10min， 去沉淀，将上清液转入另一离心管中。 (6)在上清液中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的异丙醇10ml或2倍体积乙醇，轻缓缓倒混合均匀，于-20℃放置 30min。 (7)10000 r/min 4℃离心 10min，去上清液。 (8)用2ml75%乙醇洗涤2次去除盐(可放置-20℃冰箱过液)。 (9)倒去75%乙醇，37℃干燥20分钟，再溶于600pL TE 缓冲液中，转移至1.5ml EP管(10)加入 3uL RNase A ， 37℃保温30min。 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) (11)用等体积 Trichloromethane 异戊醇溶液抽提1~3次。 (12) 10000r/min，4℃离心 10min， 吸取上清。 (13)上清液加入1/10 体积4mol/L NaCL 溶液后，加入2倍体积无水乙醇，放置 20min后， 10000r/min，离心 5min 沉淀 DNA。 (14) 沉淀用75%乙醇乙洗涤2~3次，37℃保温箱中干燥后溶于适量的 TE缓冲液中备用。 2得率的计算 由于10D260的 DNA 浓度为 50ug/ml， 因此 DNA 得率可按下公式计算： 1g新鲜组织的 DNA 含量=OD260*50×溶解体体/组织鲜重 (ug DNA/g)。 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) ( 技术中心：北京金桥科技产业基地 ) 景盛南二街33号4号楼4层 北京来亨科学仪器有限公司   一、实验原理植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同，为获得高相对分子质量DNA，应取幼嫩组织或组织培养物为材料，常以液氮冷冻下研磨的方法破组织和细胞。 由于植物材料DNase水平低，蛋白含量较少，其操作要求是要克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖与DNA共存对制备的影响。 二、实验用品  （一）器材（1）冰冻高速离心机。（2）液氮罐。（3）台式离心机。（4）电热恒温水浴锅。（5）电热恒温培养箱。（6）电冰箱，离心管和tip。（二）试剂  （1）5mol/L Nacl：称取NaCL 146.10g用蒸馏水定容至500ml。（2）CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液。      A.2mol/L Tris.HCL缓冲液（pH8.0）：24.2g Tris溶于80ml重蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.0，用重蒸水定容至100ml。      B.0.5mol/L EDTA缓冲液（PH8.0）：取186.12g EDTA.Na2用重蒸水800ml溶解，然后用NaOH调节pH至8.0，加重蒸水至1000ml。（3）巯基乙醇。（4）PVP(聚乙稀吡咯烷酮)。（5）石英砂。（6）氯仿：异戊醇（24：1），现用现配。（7）异丙醇。（8）75%乙醇。（9）TE缓冲液：取5ml 2mol/L Tris-HCL和2ml0.5mol/L EDT.Na2。用重蒸水定容至1000ml。（10）RNase A：取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5)-15mmol/L Nacl 的溶液中，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 （三）材料    水稻幼苗或蚕豆幼苗和白菜嫩叶等。 二、实验程序（一）操作方法 1.操作步聚 （1）在50ml离心管中加入10ml CTAB缓冲液。 （2）取1~2g新鲜叶片（去主脉）于研钵中，加入0.1gPVP或石英砂，在液氮中迅速研磨成粉末后，把粉末转入带CTAB缓冲液的离心管中，边加边搅拌使之混合均匀。（3）于65℃水浴保温0.5~1h。（4）冷却至室温后，加入等体积10mlTrichloromethane异戊醇溶液，颠倒混匀10min。（5）10000 r/min离心10min，去沉淀，将上清液转入另一离心管中。（6）在上清液中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的异丙醇 10ml或2倍体积乙醇，轻缓颠倒混合均匀，于-20℃放置30min。（7）10000 r/min 4℃离心10min，去上清液。（8）用2ml75%乙醇洗涤2次去除盐（可放置-20℃冰箱过液）。（9）倒去75%乙醇，37℃干燥20分钟，再溶于600µL TE缓冲液中，转移至1.5ml EP管。 (10)加入3µL RNase A ，37℃保温30min。（11）用等体积Trichloromethane异戊醇溶液抽提1~3次。（12）10000r/min,4℃离心10min，吸取上清。（13）上清液加入1/10体积4mol/L NaCL溶液后，加入2倍体积无水乙醇，放置20min后，10000r/min,离心5min沉淀DNA。（14）沉淀用75%乙醇乙洗涤2~3次，37℃保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中备用。 2得率的计算 由于1OD260的DNA浓度为50µg/ml，因此DNA得率可按下公式计算：1g新鲜组织的DNA含量=OD260×50×溶解体积/组织鲜重（µg DNA/g）。