本应用简报介绍了使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案对生物治疗样品中聚集体的定量分析。Protein A 亲和捕获在第一维中进行,而体积排阻色谱在第二维中进行。多中心切割用于将样品从第一维转移到第二维。这项技术能够在一次分析中完成整个表征,无需进行馏分收集和多次进样。
在 AdvanceBio SEC 聚集体分析之后进行 Protein A 亲和 IgG 捕获 采用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案 应用简报 生物治疗药物与生物制药 作者 摘要 Patrick Cronan、 Timothy Rice 和Michael Kruger安捷伦科技公司 本应用简报介绍了使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案对生物治疗样品中聚集体的定量分析。 Protein A 亲和捕获在第一维中进行,而体积排阻色谱在第二维中进行。多中心切割用于将样品从第一维转移到第二维。这项技术能够在一次分析中完成整个表征,无需进行馏分收集和多次进样。 Agilent Technologies 前言 蛋白质治疗远远比小分子药物的治疗复杂,因此,阐明这种复杂性成为了一个分析难题。在对这些分子进行开发和使用期间,需要对它们进行深入表征。 Protein A 是在金黄色葡萄球菌细胞壁中发现的免疫球蛋白-Fc (IgG) 受体。这种蛋白质对多克隆和单克隆 IgG (如人 IgG 1、lgG2和lgG4以及来自兔和小鼠等其他物种的IgG)具有较强的亲和性。固定化的 Protein A 常用于IgG 的制备和生产级纯化。Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 分析型色谱柱可用于对复杂混合物或纯样品中的 IgG进行快速定量分析和小规模纯化。 体积排阻色谱 (SEC) 则是生物治疗样品中聚集体定量分析的首选方法。使用 SEC 聚集体分析之后进行 ProteinAlgG 捕获,可生成更准确的表征结果,因为所分析的样品更加纯净。采用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案可使这种分析在一次进样中完成。IgG 的 Protein A 捕获在第一维中进行。然后,在多中心切割定量环中采集洗脱的IgG, 并在第二维中将其洗脱到 Agilent AdvanceBio SEC 体积排阻色谱上,以进行准确的聚集体分析。 本研究使用的二维液相色谱解决方案将 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱作为第一维系统。将1260 Infinity生物惰性液相色谱系统与安捷伦二维液相色谱 Quick-Change 快速更换阀头、多中心切割阀(带有12个出厂已安装的40pL样品定量环) 和 Agilent 1290Infinity 高速泵联用,用于第二维色谱。第二维中采用了二极管阵列检测器(DAD)。图1示出了所用的仪器模块。 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版软件以及 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱软件用于配置系统、设置二维液相色谱方法以及控制二维液相色谱的数据采集(图2)。 ( 样品 ) 样品是购自 Sigma 的 IgG标准品(部件号I9640)。 图1.第一维中配有 Agilent Bio-Monolith ProteinA 亲和色谱柱和第二维中配有 Agilent AdvanceBioSEC 的二维液相色谱解决方案配置 图2.在二维液维色谱系统中配置 Agilent OpenLab CDS ChemStation 二维液相色谱软件,并为第二梯度和多次切割设置第一参比色谱以及叠加的第一维梯度。该方法设置对话框可以轻松设置多个次数和定时事件 结果与讨论 这种二维分离有助于加快单克隆抗体(mAb) 聚集体的分析速度。在聚集体表征中将两个步骤相结合后,可以在一次进样中执行整个分析,从而省略了馏分收集步骤。图3示出了典型的Protein A 亲和捕获分离结果。用磷酸盐缓冲液捕获样品,并用500mM 乙酸(水溶液)进行洗脱。 图4表明, 当 SEC 步骤在二维分析中用作第一维时,可在样品从 Protein A亲和色谱柱中释放后立即执行该步骤。 方法 第一维分离一使用 UV 检测进行 Protein A 亲和捕获 色谱柱 Agilent Bio-Monolith ProteinA亲和色谱柱(部件号5069-3639),室温 流速 0.75 mL/min 流动相A 100 mM PBS 流动相B 500mM乙酸 梯度 0 min 时B为0% 0.5 min 时 B 为 0% 0.51 min 时 B 为 100% 2.5 min 时 B为100% 2.6 min 时 B 为 0% 第二维分离- SEC 色谱柱 Agilent AdvanceBio SEC 300 A, 4.6×150 mm, 2.7 pm(部件号PL1580-3301),25℃ 流速 0.35 mL/min 流动相 10 mM PBS pH 7.4, 等度 二维液相 多中心切割 色谱模式 图 4.使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱的 Protein A 亲和捕获以及使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱的 IgG 体积排阻色谱分离 这一流程证明了通过 Agilent 1290Infinity 二维液相色谱解决方案在一次分析中同时使用 Protein A 和 SEC 技术的可行性。在证明之余,还测试了采用二维方法对不同聚集体浓度的 SEC检测。在65℃下的热水浴中将 IgG标准品加热处理24小时。加热后得到了更大浓度的聚集体,如图5和图6所示。图6表明聚集体与单体和二聚体得到了明显分离。 结论 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案为在一个方法中测定 mAb 滴度和聚集体提供了一种通用而高效的方法,无需进行馏分收集和多重进样。Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱作为二维液相色谱工作流程的第一维,有助于在滴度测定中实现 mAb 的分析级纯化,并可在聚集体分析前作为初始纯化步骤。Agilent AdvanceBioSEC 300 A 色谱柱对聚集体与单体的分离表现出优异的分离度,可在二维液相色谱工作流程中作为第二维实现准确的评估。 图5.使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱的 Protein A 亲和捕获以及使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱的热处理 IgG 体积排阻色谱分离 图 6. IgG 和热处理 IgG的 Agilent AdvanceBio SEC 二维体积排阻色谱分离的叠加图 ( 参考文献 ) 1. Vanhoenacker, G.等, 使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案 分析单克隆抗体酶解物,安捷伦科 技公司应用简报,出版号 5991-2880CHCN, 2013 2. Lohaus, C. 等, 用 Agilent Bio- Monolith Protein A 亲和 HPLC 色谱柱快速测定人多克隆 IgG, 安捷伦科技公司应用简报,出版号 5989-9733CHCN,2008 3. Duong, P. T.采用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱监测细胞培养 液中的单克隆抗体滴度,安捷伦科 技公司应用简报,出版号 5991-2990CHCN, 2014 查找当地的安捷伦客户中心: www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线: 800-820-3278,400-820-3278(手机用户) 联系我们: LSCA-China_800@agilent.com 在线询价: www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。本文中的信息、说明和指标如有变更,恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司,2016 2016年9月1日,中国出版 5991-7223CHCN Agilent Technologies 摘要本应用简报介绍了使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案对生物治疗样品中聚集体的定量分析。Protein A 亲和捕获在第一维中进行,而体积排阻色谱在第二维中进行。多中心切割用于将样品从第一维转移到第二维。这项技术能够在一次分析中完成整个表征,无需进行馏分收集和多次进样。前言蛋白质治疗远远比小分子药物的治疗复杂,因此,阐明这种复杂性成为了一个分析难题。在对这些分子进行开发和使用期间,需要对它们进行深入表征。Protein A 是在金黄色葡萄球菌细胞壁中发现的免疫球蛋白-Fc (IgG) 受体。这种蛋白质对多克隆和单克隆 IgG(如人 IgG 1、IgG 2 和 IgG 4 以及来自兔和小鼠等其他物种的 IgG)具有较强的亲和性。固定化的 Protein A 常用于 IgG 的制备和生产级纯化。Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 分析型色谱柱可用于对复杂混合物或纯样品中的 IgG进行快速定量分析和小规模纯化。体积排阻色谱 (SEC) 则是生物治疗样品中聚集体定量分析的首选方法。使用 SEC 聚集体分析之后进行 Protein A IgG 捕获,可生成更准确的表征结果,因为所分析的样品更加纯净。采用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案可使这种分析在一次进样中完成。IgG 的 Protein A 捕获在第一维中进行。然后,在多中心切割定量环中采集洗脱的 IgG,并在第二维中将其洗脱到 Agilent AdvanceBio SEC 体积排阻色谱上,以进行准确的聚集体分析。结论Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案为在一个方法中测定 mAb 滴度和聚集体提供了一种通用而高效的方法,无需进行馏分收集和多重进样。Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱作为二维液相色谱工作流程的第一维,有助于在滴度测定中实现 mAb 的分析级纯化,并可在聚集体分析前作为初始纯化步骤。Agilent AdvanceBio SEC 300 Å 色谱柱对聚集体与单体的分离表现出优异的分离度,可在二维液相色谱工作流程中作为第二维实现准确的评估。
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