稻瘟病菌 M.oryzae中代谢物检测方案(气相色谱仪)

使用 GCxGC 和Agilent 7200 GC/Q-TOF对稻瘟病菌 Magnaportheoryzae 进行非靶向代谢组学研究 应用简报 代谢组学 摘要 作者 William C. Ledford. 全二维气相色谱 (GCxGC)可提供卓越的色谱分离度，与精确质量高分分率质谱(MS)结Margarita Marroquin-Guzman 合使用时可大大促进复杂基质中的化合物鉴定和结构解析。利用 GCxGC/Q-TOF MS 在和Richard A. Wilson 配备 Zoex ZX2 热调制器的 Agilent 7890B GC 和 Agilent 7200 GC/Q-TOF 上进行非靶植物病理学系 向代谢组学研究，可对多种可能在稻瘟病菌 M. oryzae 的致病机理中发挥重要作用的代内布拉斯加大学林肯分校 谢物进行鉴定。 Lincoln，NE USA Edward B. Ledford 和 Zhanpin Wu Zoex公司 Houston， TX USA Qingping Tao 和 Stephen E. Reichenbach GC Image LLC Lincoln， NE USA Sofia Nieto 安捷伦科技公司 Santa Clara， CA Agilent Technologies 前言 由 Magnaporthe oryzae 真菌引起的稻瘟病是最严重的栽培稻病害，也是对全球食品安全的巨大威胁，每年导致水稻作物减产10%-30%[1，2]。这种稻瘟病随气候的变化不断蔓延到新的地区。因此，迫切需要采取具有环境可持续性的稻瘟控制策略。而制定这样的策略必须对 M. oryzae 的侵染过程有深入的了解。 除作为重要的植物病原体以外，M. oryzae 还具有许多与其他重要谷物病原体相似的特性，使其成为开展广谱农作物病害控制研究的最佳模型生物体[2]。这些病原体具有共同的侵染机理，它们利用形成于叶片表面的被称为附着胞的特殊细胞，并产生巨大的静水膨压，从而使菌丝侵入下方的植物表皮细胞[1]。 M. oryzae 所采用的定殖于水稻细胞的代谢策略基本上还不为人知。本应用简报介绍了一项旨在揭示 M. oryzae 中养分吸收和利用的研究，其可能有助于阐明侵染过程，并有助于确定有效病害治理的新途径。本研究对 M. oryzae 的野生型 (WT)菌株 (Guy11)与删除余码中心氮素调节因子(△ nut1)、碳调节因子 (Amdt1)和碳-氮代谢调节因子 (^ tps1)的关键代谢调控基因后得到的非致病突变菌株的代谢组进行了比较[3]。 利用全二维气相色谱 (GCxGC)与高分辨率精确质量数四极杆飞行时间质谱(Q-TOF MS) 相结合对 M.oryzae 的 WT分离菌株与三种非致病突变菌株的代谢组进行了比较。该方法揭示出可能在M. oryzae 的致病机理中发挥作用的大量代谢产物。 实验部分 仪器 本研究采用 Agilent 7890B 气相色谱系统与 Agilent 7200 系列GC/Q-TOF系统用用(图1)。GCxGC 系统(图1和图2)吏用环形热调制器 (ZX2 型， Zoex公司， Houston，TX)。在低温下每隔6.8秒对从第一维色谱柱先脱的分析物谱带进行聚集、聚焦与重新进样(调制阶段)，从而将来自第一维色谱柱的一系列“切割组分”注入第二维色谱柱，从而在每一调制阶段洗脱出第二维色谱图。图2显示了热调制器的照片。 Q-TOF MS 在电子轰击电离(EI)和正化学电离 (PCI)模式下以每秒50张全扫描采集谱图的速率采集第二维色谱柱洗脱物的精确质量数高分辨率谱图。仪器条件列于表1中， GCxGC 的配置示意图如图3所示。 图1. 配备Zoex ZX2 热调制器的 Agilent 7890B 气相色谱系统与Agilent 7200系列 GC/Q-TOF系统联用 图2. Agilent 7890B GC 柱温箱内热调制器的照片。冷射流(蓝色点)用于收集从第一维气相色谱柱洗脱到定量环中的物质。每隔几秒即脉冲启动热射流(红色点)，以将定量环中收集的物质转移至第二维气相色谱柱。黄色点显示定量环支架的位置 表1. Agilent 7890B 气相色谱系统与 Agilent 7200 系列 GC/Q-TOF 质谱联用系统的运行条件 气相色谱条件 第一维色谱柱 Agilent HP-5MS UI， 15 m×0.25 mm， 膜厚 0.25 pm 第二维色谱柱 SGE BPX-50， 3.25m×0.1 mm， 膜厚 0.1 pm (包括用作调制环的1.0m) 进样量 1pL 分流比 15：1 分流/不分流进样口 温度 280°C 柱温箱升温程序 60°C 以3C/min 升至 310°C 载气 氦气， 1.2 mL/min， 恒流 热调制条件 热调制系统 ZOEX ZX2 调制周期 6.8 S 冷射流流速 13 L/min 热射流温度 375°C 热射流持续时间 320ms Q-TOF MS条件 传输线温度 310°C 电离模式 EI， PCI 离子源温度 300°C 四极杆温度 150°C 质量范围 60-650m/z 谱图采集速率 50 Hz 发射电流 35 uA 图3. Zoex ZX2环形热调制器的示意图 样品前处理 使 M. oryzae 的野生型 (WT) 菌株以及 D nut1、D tps1 和 D mdt1突变菌株在完全培养基中生长48小时，然后将菌丝体丛转移至基础培养基的振摇条件下生长，其中1% (w/v) 葡萄糖和10mM硝酸盐分别作为唯一的碳源和氮源。对菌丝组织样品进行收集和冻干，并在液氮中研磨。使用甲醇：氯仿：水 (1：2.5：1， v/v/v)的混合液对代谢物进行提取。向各个样品中加入内标(dzz-肉豆蔻酸)。将提取物在真空下干燥并进行甲氧化衍生，然后采用MSTFA+1%TMCS 进行硅烷化。 数据处理与统计分析 使用 Agilent MassHunter 采集软件采集数据。然后将 MassHunter数据文件导入 GC Image 软件 (GC Image， LLC) 以实现二维GCxGC 数据的可视化与进一步处理[4]。 使用 Image Investigator 软件 (GC Image， LLC) 对多样品数据集进行自动交互式多变量分析，以实现样品分类、指纹识别和标记化合物发现。使用 MassHunter 定性分析 (B.07) 精角质量数工具(如分子式生成器工具)鉴定其他未知化合物。 结果与讨论 GCxGC 特征查找 将 MassHunter 数据文件导入 GC Image 以便进一步处理。采用包括以下内容的模板对每张色谱图进行分析： 用于图像对齐的所有色谱图的共有峰(“可靠峰”) 用于定量图像对比的复合色谱图的峰区特征 通过对所有可能的成对色谱图进行双向配对匹配来确定可靠峰[5]。通过对所有色谱图进行叠加和求和形成的复合色谱图中的峰检测来确定峰区特征(图4)。 GCxGC统计分析与谱库搜索 使用各峰区中的总离子流色谱图 (TIC)计算源自复合色谱图中各类特征之间的 Fisher 判别率(FDR)。通过与NIST14 El 谱库进行谱图对比来实现 GC Image 中的初步化合物鉴定，谱图对比过程中考虑线性保留指数(RI)值。 图4. GC Image 软件中显示的复合二维色谱图，其中标注了某些已鉴定的代谢组学生物标记物 未知物鉴定与初步匹配结果的确认 使用两种电离模式鉴定未知物。电子轰击电离(EI)提供的碎片信息可用于通过 NIST14 谱库匹配进行鉴定(图5)。许多代谢物在采用甲烷作为反应应的正化学电离(PCI) 模式下可产生分子离子加合物，从而实现对初步匹配结果的验证(图5)。 图5. 初步鉴定出的焦谷氨酸的El谱图(A)及其由甲烷 PCI 模式获得的标注 MI簇(B)，后者用于验证该匹配结果的鉴定 使用 MassHunter 定性分析精确质量数工具通过El 和 PCI精确质量数据鉴定 WT 和突变菌株之间丰度不同的代谢物(表2)。使用分子式生成器 (MFG)基于精确质量数据得到这些代谢物的分子式。这些化合物的(M+H) 离子的精确质量数平均误差为 1 ppm左右。根据 GC Image 软件中测定的 FDR结果可知，这些代谢物在不同菌株之间表现出极大变异度。 表2. 已鉴定代谢产物显示出不同菌株间的极大变异度*，包含PCI模式中已确认的(M+H)*的精确质量数 (M+H) 计算出的 质量数误差 M+1同位素 化合物鉴定结果 衍生化 MI的分子式 m/z (M+H) m/z (PCI ppm) 丰度误差，% 胱硫醚 (IC1gH46N20SSi]+H) 511.233 511.2328 0.35 2.20 谷氨酰胺 ([C H34N20，Si，]+H) 363.1956 363.195 1.50 4.10 核糖酸 ([C20H500，Si，]+H) 527.2536 527.2526 1.77 N/A 肌醇 ([C24H6o0，Si]+H) 613.3079 613.3078 0.14 N/A 甘油 (LC2H320，Si]+H) 309.1731 309.1732 -0.22 2.20 苹果酸 (IC3H300，Si，]+H) 351.1485 351.1474 3.13 3.70 天门冬氨酸 ([C，HaNO Si，]+H) 350.1638 350.1634 1.18 2.20 L-苏糖酸 ([C6H400，Si]+H) 425.2027 425.2026 0.31 1.70 3-羟基异丁酸 ([CH240，Si，]+H) 249.1339 249.1337 0.80 0.90 乳酸 ([C，H，0，Si，]+H) 235.1183 235.118 1.27 0.20 L-亮氨酸 ([C2H2gNO，Si，]+H) 276.1807 276.181 -1.01 2.80 焦谷氨酸 ([CH2NO，Si，]+H) 274.1288 274.1289 -0.30 1.00 富马酸 ([CH200，Si，]+H) 261.0976 261.0973 1.12 0.80 3-磷酸甘油 ([C，sH40，PSi]+H) 461.1793 461.1791 0.53 2.10 焦磷酸盐 ([C2H360，P，Si]+H) 467.1079 467.1086 -1.60 N/A L-谷氨酸 ([C，H33NO Si，]+H) 364.1793 364.179 0.78 2.10 B-丙氨酸 ([C，HzNO，Si，]+H) 234.1342 234.134 0.88 0.90 a-羟谷氨酸 ([CH320，Si，]+C，H，) 393.1953 393.1943 2.41 0.10 2-氨基丁酸 ([CH2sNO，Si，]+H) 248.1493 248.1497 -1.52 N/A 甘氨酸 ([CHzgNO，Si，]+H) 292.1581 292.1579 0.63 0.80 4-羟基脯氨酸 ([C，H2sNO，Si，]+H) 276.1444 276.1446 -0.57 2.60 N-乙酰基-L-谷氨酸 ([C3Hz，NO，Si，]+H) 334.1503 334.1501 0.83 0.50 丙酮酸 ([C，HNO，Si]+H) 190.0897 190.0894 1.37 2.50 鸟氨酸 ([C4H36N20，Si，]+H) 349.2153 349.2157 -1.11 1.00 L-丙氨酸 ([C，HzNO，Si，]+H) 234.1342 234.134 0.77 1.80 甲瓦龙酸内酯 ([C，H80gSi]+H) 203.1095 203.1098 -1.53 0.70 平均值 1.06 1.68 * Fisher 判别率的范围为4-143 结论 本研究使用 GCxGC/Q-TOF MS 方法对 M. oryzae 的野生型分离菌株与靶向删除关键代谢调控基因得到的非致病突变菌株的代谢组进行了比较。与 nut1 基因在氮代谢中的作用、mdt1 在碳代谢中的作用以及 tps1 在碳氮综合代谢中的作用一改，各菌株中鉴别出的含碳化合物和含氮化合物存在统计显著性变化。明显变化包括形成甘油所需的功能性 Tps1 蛋白质，这种代谢产物对附着胞中膨压的产生非常重要。这些结果可提供有关代谢调节因子如何确保碳和氨准确同化为侵染过程中关键代谢物的证据。 ( 参考文献 ) ( 1. J.Fernandez， R. A. Wilson.“Cells in cells： morphogeneticand metabolic strategies conditioning ri c e infection by the blast fungus Magnaporthe oryzae"Pr o toplasma 251(1)， 37-47 ( 2014) ) ( 2 . R. A . Wilson， N. J Talbot. "Under pressure： investigatingthe biology of plant infection by Magnaporthe oryzae" Nat. Rev.Microbiol.7，185-195(2009) ) 3.. JJ. Fernandez， J. D. Wright， D. Hartline， C. F. Quispe，N. Madayiputhiya， R. A. Wilson."Principles of CarbonCatabolite Repression in the Rice Blast Fungus： Tps1，Nmr 1-3， and a MATE-Family Pump Regulate GlucoseMetabolism During Infection" PLoS Genet 8： e1002673(2012) 4. S. Reichenbach."Data acquisition， visualization， andanalysis" In Comprehensive Two Dimensional GasChromatography， Ed. L. Ramos， pp. 77-106， Elsevier， 2009 5. S. Reichenbach， X. Tian， C. Cordero， Q. Tao. "Features fornon-targeted cross-sample analysis with comprehensivetwo-dimensional chromatography"J. Chromatogr. A 1226，140-148 (2012) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com ZOEXICORPORION全二维气相色谱 (GCx GC) 专家 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 http：//zoex.com/ 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年2月18日， 中国出版 5991-6518CHCN 摘要全二维气相色谱 (GCxGC) 可提供卓越的色谱分离度，与精确质量高分辨率质谱 (MS) 结合使用时可大大促进复杂基质中的化合物鉴定和结构解析。利用 GCxGC/Q-TOF MS 在配备 Zoex ZX2 热调制器的 Agilent 7890B GC 和 Agilent 7200 GC/Q-TOF 上进行非靶向代谢组学研究，可对多种可能在稻瘟病菌 M. oryzae 的致病机理中发挥重要作用的代谢物进行鉴定。前言由 Magnaporthe oryzae 真菌引起的稻瘟病是最严重的栽培稻病害，也是对全球食品安全的巨大威胁，每年导致水稻作物减产 10%-30%。这种稻瘟病随气候的变化不断蔓延到新的地区。因此，迫切需要采取具有环境可持续性的稻瘟控制策略。而制定这样的策略必须对 M. oryzae 的侵染过程有深入的了解。除作为重要的植物病原体以外，M. oryzae 还具有许多与其他重要谷物病原体相似的特性，使其成为开展广谱农作物病害控制研究的最佳模型生物体。这些病原体具有共同的侵染机理，它们利用形成于叶片表面的被称为附着胞的特殊细胞，并产生巨大的静水膨压，从而使菌丝侵入下方的植物表皮细胞。M. oryzae 所采用的定殖于水稻细胞的代谢策略基本上还不为人知。本应用简报介绍了一项旨在揭示 M. oryzae 中养分吸收和利用的研究，其可能有助于阐明侵染过程，并有助于确定有效病害治理的新途径。本研究对 M. oryzae 的野生型 (WT) 菌株 (Guy11) 与删除编码中心氮素调节因子(D nut1)、碳调节因子 (D mdt1)和碳-氮代谢调节因子 (D tps1) 的关键代谢调控基因后得到的非致病突变菌株的代谢组进行了比较。利用全二维气相色谱 (GCxGC) 与高分辨率精确质量数四极杆飞行时间质谱 (Q-TOF MS) 相结合对 M. oryzae 的 WT 分离菌株与三种非致病突变菌株的代谢组进行了比较。该方法揭示出可能在 M. oryzae 的致病机理中发挥作用的大量代谢产物。结论本研究使用 GCxGC/Q-TOF MS 方法对 M. oryzae 的野生型分离菌株与靶向删除关键代谢调控基因得到的非致病突变菌株的代谢组进行了比较。与 nut1 基因在氮代谢中的作用、mdt1 在碳代谢中的作用以及 tps1 在碳氮综合代谢中的作用一致，各菌株中鉴别出的含碳化合物和含氮化合物存在统计显著性变化。明显变化包括形成甘油所需的功能性 Tps1 蛋白质，这种代谢产物对附着胞中膨压的产生非常重要。这些结果可提供有关代谢调节因子如何确保碳和氮准确同化为侵染过程中关键代谢物的证据。