食品和生物样品基质中未衍生化氨基酸检测方案(液质联用仪)

应用简报 Agilent食品检测、代谢组学Trusted Answers 使用液质联用系统分析未衍生化氨基酸的方法 用于食品、生命科学和代谢组学应用 Andrew Kennedy 和Adam Bivens 本应用简报介绍了一种针对未衍生化氨基酸分析优化的方法。 氨基酸的极性使其难以进行反相液相色谱分析。然而，亲水相互作用色谱 (HILIC)能保留并分离复杂的氨基酸混合物，同时还具有与传统反相色谱类似的工作流程。HILIC 与质谱的组合提供了一种简单而功能强大的氨基酸分析解决方案。 事实证明，在低pH与正离子模式 LC/MS检测条件下，采用亲水相互作用色谱(HILIC)分离未衍生化氨基酸，能够获得最佳的整体灵敏度和色谱分离性能。 AgilentInfinityLab Poroshell 120 2.7 pm HILIC-Z 和HILIC-OH5 化学键合相为氨基酸的 LC/MS分析提供了两个理想选择。二者均可对较难分离的亮氨酸/异亮氨酸同质异位素以及多种氨基酸实现完全分离。 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC级或更高等级。超LC/MS级乙腈购自J.T. Baker (CenterValley， PA， U.S.A.)。水的净化处理由EMDMillipore Milli-Q Integral 系统 (Darmstadt，Germany)完成。试剂级甲酸(FA， 部件号 G2453-85060)来自安捷伦科技公司。甲酸铵、乙酸铵、氢氧化铵和氨基酸标样购自 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO，USA)。氨基酸在使用前于-70℃下储存。 仪器和材料 Agilent InfinityLab 接头 色谱柱前端： InfinityLab QuickConnect 快速连接液相色谱接头(部件号5067-5965) 色谱柱末端： InfinityLab QuickTurn 液相色谱接头(部件号5067-5966) 安捷伦样品瓶，螺口盖，棕色，带书写签，经认证，2mL(部件号5182-0716) 安捷伦固定螺口盖，带 PTFE/红色硅胶隔垫(部件号5190-7024) 安捷伦样品瓶内插管，250uL，去活玻璃，带聚合物支脚(部件号5181-8872) Eppendorf 移液器和连续分液器 样品前处理 ( 涡旋器和多管涡旋器 (VWR，Radnor， PA，USA) ) 将氨基酸标准品与水混合至表1所列出的浓度，无需进一步样品前处理即可直接分析。 ( HDPE 溶剂瓶(VWR， Radnor， PA， USA) ) ( 流动相前处理 ) ( 仪器 ) ( A gilent 1290 Infinity Ⅱ 二元泵 (G7120A) ) ( Agilent 129 0 Infinity lI 样品瓶进样器 (G7129B) ) 用水配制200 mM甲酸铵储备液，并用甲酸将 pH 调节至3。将水与储备液按9：1稀释制得流动相A。将乙腈与储备液按9：1稀释制得流动相B。两种流动相的甲酸铵最终浓度均为20 mM。 ( Agilent 1290 Infini t y ll 高容量柱温箱 (G7116B) ) ( Agilent 1290 Infinity 液相色谱系列超 低扩散工具包(5067-5189) ) ( Agilent MassHunter 工作站软件 ) 流动相与玻璃器皿过度接触会引入离子物质，干扰并抑制质谱检测。储存在玻璃瓶中的流动相应定期更换，或将玻璃瓶换成HDPE 瓶。 ( Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统 ) ( 安捷伦喷射流电喷雾离子源 ) 仪器条件 参数 值 HPLC 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z， 2.1×100 mmAgilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-OH5， 2.1×100 mm 流动相A 10% (200mM甲酸铵水溶液， pH=3) /90% 水 流动相B 10% (200mM甲酸铵水溶液， pH=3)/90%乙青 流速 0.80 mL/min 柱温 30°C 进样量 0.25 pL 总运行时间 16分钟 梯度 时间(min) %B 0 10010 7011 100 MS 电离模式 ESI正离子模式 干燥气温度 300°℃ 干燥气流速 7.0 L/min 雾化器压力 45 psi 鞘气温度 400°℃ 鞘气流速 11L/min 毛细管电压 3500V 喷嘴电压 0V 分析物 浓度(mM) Agilent InfinityLab Poroshell120 HILIC-Z RT (min) Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-0H5 RT (min) 母离子 (m/z) 子离子(m/z) 碎裂电压 (V) 碰撞能量 (V) 驻留时间(ms) 苯丙氨酸 0.25 2.12 2.47 166.1 120.1 25 5 10 亮氨酸 0.25 2.34 2.74 132.1 86.1 25 8 10 异亮氨酸 0.25 2.50 2.93 132.1 86.1 25 8 10 甲硫氨酸 0.25 2.71 3.09 150.0 104.0 75 8 10 酪氨酸 0.25 3.07 3.27 182.1 136.1 25 12 10 缬氨酸 0.25 3.11 3.54 118.1 72.1 25 8 10 脯氨酸 0.25 3.16 3.75 116.1 70.1 50 16 10 丙氨酸 0.25 3.73 4.13 90.1 44.1 25 8 10 苏氨酸 0.25 3.82 4.16 120.0 74.1 25 10 10 甘氨酸 0.25 4.08 4.51 76.0 30.1 25 5 10 丝氨酸 0.25 4.27 4.56 106.1 60.1 25 8 10 谷氨酸 0.25 4.71 5.43 148.1 84.1 75 16 10 天冬氨酸 0.25 5.25 6.14 134.0 74.0 50 15 10 组氨酸 0.25 5.59 5.87 156.1 110.0 25 12 10 精氨酸 0.25 6.09 5.91 175.1 70.1 75 28 10 赖氨酸 0.25 6.54 6.63 147.1 84.1 50 16 10 注：所有离子对的碰撞池加速电压均为4V。 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0采集时间 (min) 图1.使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱得到的氨基酸分离结果。 亮氨酸/异亮氨酸选择性为1.08 采集时间(min) 图2.使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-0H5 色谱柱得到的氨基酸分离结果。亮氨酸/异亮氨酸选择性为1.08 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( 2017年12月1日，中国出版 ) 使用 HILIC 在正离子模式 LC/MS条件下对氨基酸实现了成功分析 Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z显示出更好的总体峰形，对天冬氨酸和组氨酸等碱性更强的化合物更是如此 Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-0H5对酪氨酸、缬氨酸和脯氨酸等早洗脱峰表现出更高分离度 这两种色谱柱对通常难以分析的亮氨酸/异亮氨酸同质异位素也实现了基线分离 · Agilent◎安捷伦科技(中国)有限公司，rusted AnswersHCN 摘要本应用简报介绍了一种针对未衍生化氨基酸分析优化的方法。氨基酸的极性使其难以进行反相液相色谱分析。然而，亲水相互作用色谱 (HILIC) 能保留并分离复杂的氨基酸混合物，同时还具有与传统反相色谱类似的工作流程。HILIC 与质谱的组合提供了一种简单而功能强大的氨基酸分析解决方案。前言事实证明，在低 pH 与正离子模式 LC/MS 检测条件下，采用亲水相互作用色谱 (HILIC) 分离未衍生化氨基酸，能够获得最佳的整体灵敏度和色谱分离性能。Agilent InfinityLab Poroshell 120 2.7 μm HILIC-Z 和 HILIC-OH5 化学键合相为氨基酸的 LC/MS 分析提供了两个理想选择。二者均可对较难分离的亮氨酸/异亮氨酸同质异位素以及多种氨基酸实现完全分离。结论• 使用 HILIC 在正离子模式 LC/MS 条件下对氨基酸实现了成功分析• Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 显示出更好的总体峰形，对天冬氨酸和组氨酸等碱性更强的化合物更是如此• Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-OH5 对酪氨酸、缬氨酸和脯氨酸等早洗脱峰表现出更高分离度• 这两种色谱柱对通常难以分析的亮氨酸/异亮氨酸同质异位素也实现了基线分离