RNA 样品中质量控制检测方案(生物芯片)

采用安捷伦 2200 TapeStation 系统进行RNA质量控制-RIN质量指标的评价 应用简报 核酸分析 作者 Arunkumar Padmanaban安捷伦科技公司 印度班加罗尔 摘要 本应用简报描述了安捷伦2200 TapeStation 系统与安捷伦2100 生物分析仪间的性能比较及基准，后者是 RNA质量控制的行业标准。2200 TapeStation 系统可对最多96个样品进行自动化分析，每个样品的分析时间约为1分钟。本应用简报展示了2200 TapeStation 系统生成的 RIN°与2100生物分析仪的 RIN 质量评估之间的高度相关性。此外还展示了 2200 TapeStation 系统在 RNA 质量评估中所得 RIN°的高度重现性。因此，2200 TapeStation 系统是可靠的 RNA质量控制系统。 前言 RNA的结构完整性是确保微微列、cDNA文库构建， RT-PCR 及 RT-qPCR之类实验成功的最重要因素。采用微阵列技术及 qPCR 进行基因表达研究越来越得到重视，这就需要可靠耐用的 RNA 完整性分析方法'。安捷伦2100生物分析仪及其RNA 完整值 (RIN) 是 RNA质量平估的行业标准。最新推出的安捷伦2200TapeStation 系统建立在2100生物分析仪系统的成功之上，且分析时间更短，每个样品成本固定的情况下，通量灵活性提高，且具有分析96孔板的能力。 2200 TapeStation 系统的分析采用现成的消耗品ScreenTape 预制胶条。安捷伦 R6K ScreenTape 及安捷伦高灵敏度 R6K ScreenTape 包括16个独立的泳道。由于 ScreenTape 消耗品中未使用的泳道可留待随后的分析，因此在每个样品成本固定的情况下，通量可为2到96个样品不等。2200 TapeStation 仪器可自动将制备的样品从8联管条中或96孔板中上样至R6K ScreenTape。电泳及成像也是在该仪器中自动完成的。2200TapeStation软件可为每个样品提供胶图及电泳图谱结果，并可在短至1分钟内进行查看。采用 R6K ScreenTape 及高灵敏度R6K ScreenTape 进行RNA质量分析可得到 RIN 对应值 (RIN°)。RIN°的值可在1到10之间，其中10代表了最高质量的RNA样品。本文中，我们进行了一项对比研究，比较了 R6K ScreenTape 及高灵敏度R6K ScreenTape 所得的 RIN°质量评分与2100生物分析仪所得的 RIN 质量指标。 设备 仪器及试剂盒 RNA 6000 Nano 及 RNA 6000 Pico 试剂盒、2100生物分析仪系统、2200 TapeStation系统、R6K ScreenTape 及高灵敏度 R6KScreenTape 试剂盒均来自安捷伦科技(德国瓦尔德布隆)，并根据制造商说明3.4.5使用。采用安捷伦科技(美国加利福尼亚州圣克拉拉市)的总 RNA分离小提试剂盒，根据制造商指南提取 HEK 293 及HEP G2细胞的 RNA。 样品 总共采用23个 RNA样品进行基准研究，并分成三种类型： 商品化样品 ( 商品化的不同哺乳动物组织的总 RNA提取物来自安捷伦科技(美国圣克拉拉拉)。 标准品浓度为1 pg/pL，包括从人肺、脑、卵巢、肾上腺、心脏、结肠、胎肝及鼠 肝和肾中提取的RNA。利用经佛波醇肉 豆蔻酸乙酸酯(PMA)处理及未处理的人 Jurkat 细胞系和 Hela 细胞系提取的 RNA也来自安捷伦科技。1pL样品用于 RNA6000 Nano 及 R6K试剂盒， 2pL用于 RNA6000 Pico 及高灵敏度 R6K ScreenTape试剂盒。每个样品在 50 ng/pL浓度下用 RNA6000 Nano 及 R6K试剂盒重复分析四次， 然后稀释成1000 pg/pL， 并采用 RNA 6000 Pico 及高灵敏度 R6K 试剂盒重复分析四次。 ) 降解样品 50 ng/pL 的人 Jurkat 细胞 RNA 样品在90°C下进行连续加热降解。分别在时间点 t=0、2、5、7、8、9、15及18分钟时对 RNA进行取样，然后在冰上孵育以终止降解，并立即处理进行分析。样品用RNA 6000 Nano 及 R6K试剂盒重复分析六次，然后稀释50倍， 并采用 RNA 6000Pico 及高灵敏度 R6K试剂盒重复分析六次。 提取样品 采用含有 10% FBS 及 1% Pen/Strep 的MEM培养基在37°C及含5% CO 的培养箱中培养两种细胞系， HEK 293 (购自ATCC， 美国ATCC) 和 HEP G2(Connexious公司，印度班加罗尔)。80%融合度时收获细胞，冻存在-80°C直到进一步使用。对于 HEK 293， 从1.76×10°细胞/mL的细胞群中提取RNA， 而对于 HEPG2， 从2.2×10°细胞/mL的细胞群中提取RNA。人胃肠道癌组织中提取的 RNA样品来自IOB-生物信息学研究所(印度班加罗尔)。这些细胞系和组织的总 RNA由2100生物分析仪及2200 TapeStation系统分析，均重复六次。 ( 所有的分析均在不同的三天内重复三次。 ) 结果和讨论 RNA分析 商品化样品、降解样品和提取样品组由 2200 TapeStation 系统进行分析。样品制备备上样至2200 TapeStation 系统。图1A说明了在 R6K ScreenTape 上分析不同的 RNA 样品所得的结果。胶图表示每个样品的分离谱，显示了28S、18S、小rRNA及下位内标。每个样品的 RNA质量由RIN°值表示，如胶图下数字所示。图1B展示了经 PMA处理的 Hela 细胞所得总 RNA的代表性电泳图谱。其中对 28S 及 18S峰进行了标注。 图1 利用安捷伦2200 TapeStation 系统进行的 RNA 分析。A)胶图展示了不同的 RNA 样品。B)经PMA 处理的 HelA 细胞所得总 RNA 的代表性电泳图谱，其中标注了18/28S 峰。 加热降解 RNA 分析 通过分析加热降解的RNA样品，评价2200TapeStation 系统在降解 RNA的质量评分中的性能。采用 R6K ScreenTape及高灵敏度 R6K ScreenTape 分析降解的 Jurkat 细胞总 RNA样品， 并与2100生物分析仪系统所得结果进行比较。2200 TapeStation及2100生物分析仪系统的分析均发现随着时间的进展，28S 峰逐步降解，降解产物逐步增加。 图2展现了加热降解 RNA 样品的电泳叠加图谱， 由 R6K ScreenTape 及 RNA6000 Nano 试剂盒分析所得。 [s] 图2 加热降解的 Jurkat 细胞 RNA 样品的电泳叠加图谱。A) R6K ScreenTape (安捷伦 2200 TapeStation) 所得结果。B) RNA 6000 Nano试剂盒(安捷伦2100生物分析仪)所得结果。 RIN 及 RIN°相关性 RNA样品，包括商品化样品、降解样品及提取样品均由2100生物勿析仪及2200TapeStation 系统进行分析。取每个样品重复分析的平均 RIN 值，并将其与TapeStation 所得的平均 RIN° 值进行比较(图3)。该分析说明两个系统具有高度正相关， RNA 6000 Nano 试剂盒与 R6KScreenTape 间的R²值为 0.9878， 而RNA 6000 Pico 试剂盒与高灵敏度 R6KScreenTape 间的 R’值为 0.9474。通常R6K ScreenTape 所得 RIN 的偏差 <4%， 而高灵敏度R6K ScreenTape 所得偏差<7%。 单因素方差分析指出 RNA 6000 Nano 试剂盒与 R6K ScreenTape间 [F(5，132)=0.104，p=0.991]， 及 RNA 6000 Pico 试剂盒与高灵敏度 R6K ScreenTape 间 [F (5，132)=0.295，p=0.914]均无显著性差异。 图3 由商品化、提取及降解的 RNA样品所得值绘制的相关性曲线 A) RNA 6000 Nano 及 R6K试剂盒所得的 RIN 及RIN°值图。B) RNA 6000 Pico 及高灵敏度 R6K试剂盒所得的 RIN 及RIN值图 重现性 整理对照30 个 RNA 6000 Nano 芯片与27个R6K ScreenTape 的结果， 以及36个RNA 6000 Pico 芯片与27个高灵敏度R6KScreenTape 的结果，以此通过与2100生物分析仪系统比较，对 2200 TapeStation系统的重现性进行评估。计算众多样品及不同降解水平得到的 RIN 及 RIN°值的重现性CV。分别取单个芯片或 ScreenTape所得样品的平均值，以及多个芯片或ScreenTape 的平均值，计算分析内及分析间精密度。 表1列出了两个系统所得的%CV。相比2100 生物分析仪系统，2200 TapeStation系统的精密度更高，这是因为自动化样品处理及上样可降低人工移液的误差。 % CV均值 RNA 6000 R6K 高灵敏度 R6K 分析指标 Nano ScreenTape RNA 6000 Pico ScreenTape 分析内精密度 <3% <2% <4% <2% 分析间精密度 <3% <2.5% <6% <3% 表1 RIN 及 RIN的精密度 结论 ( 安捷伦 2200 TapeStation 系统为 RNA样品的分析提供了一种简便易用的系统，人工干预可降至最低。 R 6 K 及高灵敏度 R6KScreenTape 经证实可精确可靠地进行RNA 质量控制，可媲美安捷伦2100生物分析仪系统。2200 TapeStation 系统还在样品重现性方面展示出极高的精密度。 ) ( 因此，在RNA质量评估方面，2200TapeStation 系统可提供与行业标准2100生物分析仪系统媲美的性能。高通量兼容性、简单易用、最少人工干预，以及不论通量大小，每个样品的成本固定，这些新增的优点结合起来，使 2200 TapeStation系统成为 RNA质量评估的理想之选。 ) ( 参考文献 ) 1. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance， Mol.Aspects Med. 2-3， 126-139，2006 2. The MIQE guidelines： minimuminformation for publication ofquantitative real-time PCR experiments，Clin.Chem.4， 611-622，2009 3. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide (安捷伦 RNA 6000 Nano 试剂盒说明)， Agilent Technologies (p/n G2938-90034) ( 4. Agilent RNA 6000 Pico Kit Guide ) (安捷伦 RNA 6000 Pico试剂盒说明)， Agilent Technologies(p/n G2938-90046) 5. Agilent R6K ScreenTape System Quick Guide (安捷伦 R6K ScreenTape 系统 快速指南)， Agilent Technologies (p/n G2964-90020) 6. Agilent Total RNA Isolation Mini Kit Guide (安捷伦总RNA分离小提式剂盒 指南)， Agilent Technologies (p/n5188-2710) www.agilent.com/genomics/tapestation C安捷伦科技(中国)有限公司，2012 2012年3月1日，中国出版 5991-0023CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要本应用简报描述了安捷伦 2200 TapeStation 系统与安捷伦 2100 生物分析仪间的性能比较及基准，后者是 RNA 质量控制的行业标准。2200 TapeStation 系统可对最多 96 个样品进行自动化分析，每个样品的分析时间约为 1 分钟。本应用简报展示了2200 TapeStation 系统生成的 RINe 与 2100 生物分析仪的 RIN 质量评估之间的高度相关性。此外还展示了 2200 TapeStation 系统在 RNA 质量评估中所得 RINe 的高度重现性。因此，2200 TapeStation 系统是可靠的 RNA 质量控制系统。前言RNA 的结构完整性是确保微阵列、cDNA 文库构建，RT-PCR 及 RT-qPCR1 之类实验成功的最重要因素。采用微阵列技术及 qPCR 进行基因表达研究越来越得到重视，这就需要可靠耐用的 RNA 完整性分析方法。安捷伦 2100 生物分析仪及其 RNA 完整值 (RIN) 是 RNA 质量评估的行业标准。最新推出的安捷伦 2200 TapeStation 系统建立在 2100 生物分析仪系统的成功之上，且分析时间更短，每个样品成本固定的情况下，通量灵活性提高，且具有分析 96 孔板的能力。2200 TapeStation 系统的分析采用现成的消耗品 ScreenTape 预制胶条。安捷伦 R6K ScreenTape 及安捷伦高灵敏度 R6K ScreenTape 包括 16 个独立的泳道。由于 ScreenTape 消耗品中未使用的泳道可留待随后的分析，因此在每个样品成本固定的情况下，通量可为 2 到 96 个样品不等。2200 TapeStation 仪器可自动将制备的样品从 8 联管条中或 96 孔板中上样至 R6K ScreenTape。电泳及成像也是在该仪器中自动完成的。2200 TapeStation 软件可为每个样品提供胶图及电泳图谱结果，并可在短至 1 分钟内进行查看。采用 R6K ScreenTape 及高灵敏度 R6K ScreenTape 进行 RNA 质量分析可得到 RIN 对应值 (RINe)。RINe 的值可在 1 到 10 之间，其中 10 代表了最高质量的 RNA 样品。本文中，我们进行了一项对比研究，比较了 R6K ScreenTape 及高灵敏度 R6K ScreenTape 所得的 RINe 质量评分与 2100 生物分析仪所得的 RIN 质量指标。结论安捷伦 2200 TapeStation 系统为 RNA 样品的分析提供了一种简便易用的系统，人工干预可降至最低。R6K 及高灵敏度 R6K ScreenTape 经证实可精确可靠地进行 RNA 质量控制，可媲美安捷伦 2100 生物分析仪系统。2200 TapeStation 系统还在样品重现性方面展示出极高的精密度。因此，在 RNA 质量评估方面，2200 TapeStation 系统可提供与行业标准 2100生物分析仪系统媲美的性能。高通量兼容性、简单易用、最少人工干预，以及不论通量大小，每个样品的成本固定，这些新增的优点结合起来，使 2200 TapeStation系统成为 RNA 质量评估的理想之选。