FFPE 样品中外显子序列捕获检测方案(生物芯片)

Jesse D. Luce、 Prashant K. Singh、 Sean T. Glenn 罗斯威尔帕克癌症研究所 Josh Zhiyong Wang、 美国加利福尼亚州圣克拉拉 六种不同文库制备试剂盒用于 FFPE样品外显子序列捕获应用的比较 外显子组测序和靶向基因组合测序是常用的新一代测序 (NGS)方法，用于鉴定和表征科研与临床样品(如癌症样本)中的不同基因突变。基因组合靶标设计、实验室处理操作和生物信息学分析等许多因素都会影响变异/畸变检测的灵敏度和准确性。本文展示相同 FFPE 样品在多个供应商的六种不同文库制备试剂盒中得到的对比结果。在100X原始测序深度下， Agilent SureSelectTHS 文库制备试剂盒在四个关键指标上表现出最佳性能，即在靶率、平均读出序列深度、20X读出序列深度下的靶标碱基覆盖率以及捕获前文库产率。供应商A试剂盒在 20X读出序列深度下的靶标碱基覆盖率和捕获前文库产率两个指标中排名第二；供应商E在在靶率和平均读出序列深度两个指标中排名第二。总体来说， Agilent SureSelectXTHS 试剂盒的性能优于评估的其他5种试剂盒。 前言 检测 DNA 样品中出现的遗传变异是基础与临床研究中至关重要的一步。靶向测序和外显子组测序是研究具有复杂突变谱样品(如肿瘤样品)的重要工具。聚焦于与疾病或表型相关的选定基因或基因区域，可使研究人员以更经济的方式进行更深度的测序。 在不同的靶标序列捕获工作流程中，杂交型靶向序列捕获可提供极大的灵活性和高质量的测序数据。标准靶标序列捕获工作流程包括捕获前 DNA 文库制备、目标区域的杂交捕获以及捕获后 PCR，以产生足够的测序文库。为最大限度提高杂交捕获效率，捕获前文库必须具有高产率和高复杂度。不同的市售文库制备试剂盒利用不同的酶、试剂和工作流程来优化捕获前文库制备效率。 Agilent SureSelectXTHS文库制备试剂盒1专门针对完整样品和FFPE 样品进行了优化，分析周期为8小时， DNA 起始量低至10ng。分子条形码功能可准确灵敏地检测低频等位基因变异。最近一项研究表明， SureSelect*THS 工作流程能够实现高灵敏度(检测极限约为0.1%)和易定制化的 ctDNA 测序。 在本应用简报中，我们对比了六个不同供应商的文库制备试剂盒。由4个降解 FFPE 样品制备捕获前文库，然后与 AgilentSureSelect 人全外显子V6杂交。在 Illumina HiSeq2500 上对捕获文库进行测序。用多个测序 QC指标确定这些试剂盒的性能。 样品与文库制备 本研究使用四种黑色素瘤 FFPE样品，分别分为 FFPE1、FFPE2、FFPE3 和 FFPE4。使用安捷伦 NGS FFPE 质控试剂盒(ddCq 范围为0.23-2.32)确定样品的质量 (ddCq 值)。采用 Covaris S220 聚焦超声发生器对 DNA 进行打断。在所有QC步骤中使用 Agilent 4200 TapeStation 评估打断、文库制备和捕获后 PCR步骤中的 DNA 片段大小。 使用 SureSelectXTHS 和五种其他文库制备试剂盒(分别以供应商 A、B、C、D和E表示)制备文库，共六种文库。在产生捕获前文库后，按照制造商的方案用 Agilent SureSelect 人全外显子 v6 进行杂交捕获。将捕获后 PCR 循环次数设为9。安捷伦产品信息见表1。 表1.本研究所用的安捷伦产品 产品名称 目录号 SureSelectXT HS 试剂盒，标签1-16+ G9704K 人全外显子组 v6靶向序列捕获探针，16次反应 SureSelectXT HS 试剂盒，标签17-32+ G9705K 人全外显子组v6靶向序列捕获探针，16次反应 SureSelectXT HS试剂盒，标签1-32+ G9706K 人全外显子组v6靶向序列捕获探针，96次反应 将最终文库混合并以 16 pM 加载，用于多个快速模式v2流通池的板上簇生成，然后在Illumina HiSeq 2500 系统上按每份样品约40-80M 读出序列的深度测序2×100个循环。采用Illumina CASAVA 1.8.2软件执行碱基识别和多重性分解。 数据分析 将过滤后的读出序列归一化至六千万个读出序列，达到100X的测序深度，然后用 BWA 比对工具将其映射到参考人基因组(hg19)。三个文库未能产生六千万个读出序列，其中包括使用供应商A的 FFPE2和使用供应商C的FFPE3。采用 bedtools(http：//bedtools.readthedocs.io/en/latest/) 分析测序指标(在靶率和读出序列深度)。使用 Agilent SureCall 软件分析Agilent SureSelectXTHS文库分子条形码。 六种不同试剂盒捕获前文库产率对比 由于 FFPE DNA 样品在质量或降解程度方面可能有很大差异，使用 Qubit对 FFPE DNA样品的 DNA 定量分析并不能反映可扩增数量，而这一指标在涉及 PCR 的许多 NGS 应用中至关重要。因此，用于测定 FFPE DNA样品质量和可扩增数量的qPCR 方法成为了产生归一化 DNA 完整性评分(ddCq) 的常用方法，较低的 ddCq 值表示样品质量较好，较易扩增。本对比研究选择的四种 FFPE DNA 样品分别命名为 FFPE1、FFPE2、FFPE3 和FFPE4，各自ddCq 值分别为0.23、0.57、2.08和2.32。对于本对比研究，根据每个 FFPE 样品的 Qubit浓度使用100 ng 的 DNA起始量。由于所有非安捷伦试剂盒方案均未要求根据 ddCq 周调整 DNA 起始量，因此本研究也不根据其ddCq 值调整 DNA起始量。 本研究包含 SureSelectXTHS试剂盒以及另外5个指定供应商A、B、C、D和E的非安捷伦文库制备试剂盒。请注意，以上六种试剂盒的实验方案均包含七个类似步骤：基因组DNA剪切、末端修复、dA 加尾、接头连接、捕获前 PCR、捕获杂交和最终文库的捕获后 PCR。但是，以上方案在所执行的Agencourt AMPureXP纯骤步骤(2-6步)数量、每个酶催化步骤的孵育时间、PCR 循环次数以及由此产生的文库制备总操作时间方面存在较大差异。 表2对比了使用六种文库制备试剂盒对上述4种FFPE样品的捕获前文库产率。PCR 循环次数影响整体文库产率，循环次数越多，产率越大。三种试剂盒(供应商A、供应商D和供应商E)根据其方案建议采用了10次循环，而另外三种试剂盒(Agilent SureSelectTHS、供应商B、供应商C) 根据各自方案采用了12次循环。通常，与样品 FFPE3 或 FFPE4 相比，使 用样品 FFPE1 和 FFPE2 的所有试剂盒 PCR 产率更高。这可能是由于 FFPE1 和 FFPE2 的 ddCq 值较低，因此具有较高的DNA完整性，更适用于 PCR。在采用10次 PCR 循环的三种试剂盒中，供应商A的试剂盒比供应商D和供应商E 的试剂盒文库产率更高。在采用12次PCR 循环的三种试剂盒中，Agilent SureSelectXTHS试剂盒比供应商B和供应商C试剂盒的捕获前文库产率更高。事实上， Agilent SureSelectXTHS 试剂盒产生的捕获前文库 DNA 是竞争对手试剂盒的2.5-6倍。 表2.捕获前文库制备产率对比 (ng DNA) ddCq 供应商A 供应商B 供应商C 供应商D 供应商E AgilentXTHS PCR 循环次数 10 12 12 10 10 12 FFPE1 0.23 1052 398 476 316 588 2580 FFPE2 0.57 633 358 540 251 386 1605 FFPE3 2.08 325 161 464 189 296 762 FFPE4 2.32 355 139 378 278 355 2100 总体来说， Agilent SureSelectXTHS和供应商A试剂盒的捕获前文库制备产率居于六种试剂盒的前两名。使用方案中的默认参数， Agilent SureSelectXTHS 试剂盒可在所有4个FFPE样品中得到稳定的捕获前文库产率。样品 FFPE3的产率稍低，为762ng， 但已足够进行捕获杂交。 在靶测序率对比 对于 SureSelectXTHS 文库的测序数据，需要使用 AgilentSureCall 软件进行额外分析，以包括分子条形码信息的读出序列。这些数据在本应用简报中以“Agilent XT HS MBC”表示(图1-3)。 评估外显子组靶向序列捕获工作流程的性能时，外显子组区读出序列百分比是一个有用的指标。使用国际 HapMap 项目的高质量样品和 Agilent SureSelect 人全外显子V6捕获文库时，在靶率通常可达70%-85%。图1所示为本研究中试剂盒得到的所有文库的在靶率对比。对于 SureSelectT HS和 SureSelect卜T HS MBC 数据而言，尽管 FFPE3 和 FFPE4 由于 ddCq 值较低而质量远低于 FFPE1 或 FFPE2， 但所有4种FFPE 样品的在靶率始终保持在75%-85%之间。上述结果说 明 SureSelectXTHS试剂盒在各种不同质量 FFPE 样品中都保持了高水平性能(按照在靶率)，且在使用降解程度更高的FFPE样品时，其在靶率指标明显优于其他试剂盒(图1)。 图 1. DNA测序在靶率对比 相比之下，其他供应商的文库制备试剂盒的在靶率较低。供应商E的试剂盒在其中表现最佳，在靶率始终保持在65%-71%之间，比 Agilent SureSelectXTHS 试剂盒的在靶率低 10%-15%左右。使用竞争对手试剂盒对两种低质量样品(FFPE3和FFPE4) 获得的在靶率低于高质量 FFPE1 和 FFPE2样品的在靶率。例如，使用供应商A和供应商B试剂盒时， FFPE4 样品获得的在靶率分别为 46.1%和 47.5%。供应商C试剂盒在四个FFPE样品中产生的在靶率始终保持在57%至59.4%之间。 在 20X读出序列深度下的平均读出序列深度与靶标碱基覆盖率对比 靶向 NGS 实验的主要目的是在目标基因组区域产生足够的读出序列深度，从而可靠地鉴定出参考序列的变异。因此，确定靶向序列捕获解决方案的有效性时，根据所达到的平均测序读出序列深度以及在特定读出序列深度(10X、20X或 100X等)处的靶标碱基覆盖率评估的性能是最重要的 QC 指标。由于使用了相同的捕获探针组 (SureSelect 人全外显子 v6)，所观察到的差异均是由用于对比的文库制备试剂盒引起的，而不是捕获杂交探针组。 通常，实验所需的测序读出序列深度取决于预期突变的等位基因频率。在预期纯合子或杂合子基因突变的遗传性疾病样品NGS 实验中，认为20X的读出序列深度足以实现高度可靠的 变异识别。然而，在预期低频等位基因变异的癌症样品 NGS实验中，可能需要200X、1000X甚至20000X的读出序列深度以及分子条形码分析，才能实现高度可靠的变异识别。 但是，在测序实验中，20X读出序列深度下的较高靶标碱基覆盖率通常与超过 100X或 1000X 读出序列深度的较高靶标碱基覆盖率相关。因此，在本应用简报中，尽管使用 FFPE 癌症样品进行外显子组测序，但仍将平均读出序列深度和20X读数深度下的靶标碱基覆盖率作为 QC指标，来对比六种不同的文库制备试剂盒。 表3显示了所有试剂盒和所有四种 FFPE 样品的平均读出序列深度以及在20X读出序列深度数据下的靶标碱基覆盖率。图2显示了与原始测序读出序列深度为100X的多数样品进行的平 均读出序列深度对比，对比中不包括上文(材料与方法)提到的测序深度为75X-85X的3个样品。对于FFPE1 和 FFPE2样品， Agilent SureSelectXT HS 试剂盒在所有试剂盒(表3)中具有最高读出序列深度(62X与71X)， 供应商 D 试剂盒(52X与65X)和供应商E 式剂盒(60X与56X)的读出序列深度排名第二。对于 FFPE3 样品，供应商D试剂盒(52X)和供应商E试剂盒 (46X)具有最高的平均读出序列深度。但对于FFPE4 样品， Agilent SureSelectXT HS 试剂盒再次成为表现最佳的产品，平均读出序列深度为60X， 供应商E试剂盒(52X)排名第二。 图3对比了所有六种试剂盒在20X读出序列深度下的靶标碱基覆盖率。对于 FFPE1 和 FFPE2 样品， Agilent SureSelectHS Agilent XT HS Agilent XT HS MBC FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 读出序列数 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 平均读出序列深度： 62 71 39 60 55 64 39 55 至少1个读出序列： 97.7% 97.3% 97.4% 97.4% 97.7% 97.3% 97.3% 97.3% 至少10个读出序列： 94.6% 92.8% 92.8% 91.6% 93.8% 91.8% 92.1% 90.4% 至少20个读出序列： 87.0% 85.1% 81.2% 80.3% 84.3% 82.7% 79.4% 77.5% 至少50个读出序列： 51.7% 56.7% 29.5% 45.7% 45.3% 51.0% 28.8% 41.2% 供应商A 供应商B FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 读出序列数 60M 46.6M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 平均读出序列深度： 51 41 42 34 49 44 28 26 至少1个读出序列： 97.8% 97.7% 97.4% 97.4% 97.7% 97.6% 97.2% 97.2% 至少10个读出序列： 95.3% 94.2% 93.8% 87.2% 94.3% 94.3% 88.5% 83.3% 至少20个读出序列： 86.2% 82.1% 82.6% 62.1% 82.4% 83.3% 65.5% 54.7% 至少50个读出序列： 40.3% 28.1% 30.2% 19.7% 37.1% 33.4% 9.9% 10.6% *78X测序深度 供应商C 供应商D 供应商E FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 读出序列数 60M 51M 45M" 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 平均读出序列深度： 51 44 33 42 52 65 52 43 60 56 46 52 至少1个读出序列： 97.8% 97.7% 97.3% 97.5% 97.2% 97.3% 96.7% 95.8% 97.1% 97.0% 96.5% 96.3% 至少10个读出序列： 95.2% 94.5% 89.9% 91.1% 82.8% 88.0% 83.6% 72.2% 82.3% 83.9% 81.6% 77.3% 至少20个读出序列： 84.9% 82.3% 70.5% 74.0% 62.7% 72.2% 65.4% 50.6% 63.5% 65.1% 62.3% 56.4% 至少50个读出序列： 39.2% 31.1% 17.7% 28.7% 34.2% 41.4% 34.2% 27.1% 37.3% 35.5% 30.7% 31.1% 试剂盒的性能最佳(分别为87%和85.1%)，供应商A试剂盒(86.2%和82.1%)位居第二，供应商C试剂盒(84.9%和82.3%)和供应商B试剂盒(82.4%和83.2%))3紧随其后。供应商D或供应商E试剂盒的性能大幅下降(62%-72%))，结果令人惊讶，因为供应商D和供应商E试剂盒的平均读出序列深度较为出色。可能的原因是，供应商D和供应商E试剂盒在不同靶标碱基上无法产生良好的一致性，较高的平均读出序列深度是由某组深度覆盖率非常高的靶标碱基获得的。 对于 FFPE3 和 FFPE4样品 (ddCq 值最差的两个样品)， Agilent SureSelectTHS 试剂盒表现出了最佳性能，在20X读出序列深度 下分别具有81.2%和80.3%的靶标碱基覆盖率。供应商A试剂 盒(82.6%和62.1%)和供应商C试剂盒(70.5%和74.0%)的 平均测序深度： 78xX 85x◆75x 图2.除非特别说明，100X测序深度(六千万个读出序列)下的平均读出序列深度对比 平均测序深度： 78x 85x◆75x 靶标碱基覆盖率分别位居第二和第三。采用 FFPE1 和 FFPE2样品时供应商B和供应商C试剂盒的性能相似，但采用 FFPE3和 FFPE4 样品时二者性能差异很大。结果表明供应商C试剂盒在处理降解程度更高的 FFPE样品方面比供应商B试剂盒性能更好(图3)。总体而言， Agilent SureSelectXTHS 试剂盒是唯一能够在 20X 读出序列深度下始终实现至少80%靶标碱基覆盖率，且所有4种不同质量 FFPE 样品均有100X测序深度的试剂盒。此外， Agilent SureSelectXTHS 试剂盒在读出序列深度为50X时具有最高的靶标碱基覆盖率，表现出卓越的性能一致性。 Agilent SureSelectTHS 试剂盒的附加功能 本研究根据 Qubit 值以 100 ng 的 DNA 起始量进行文库制备，不考虑样品的降解状态，以便在相同参数下评估所有试剂盒。应该注意， Qubit 值不能反映出 DNA 的可扩增量，LDNA起始量的确定也应考虑据其他 DNA 完整性指标，例如 ddCq值或 DNA完整值(DIN)。在评估的六种试剂盒中， AgilentSureSelectXTHS 试剂盒是唯――款以 DNA 质量为调整起始量和测序深度提供指导的试剂盒。 Agilent SureSelectXTHS 试剂盒也是唯一包含分子条形码技术的试剂盒，p可提高变异识别准确度，并能灵敏地检测低频等位基因变异。请注意，当测序读出序列深度较高(>10000X) 和/或gDNA 起始量较低(<=25ng)时，分子条形码分析对整体读出序列深度(去冗余后)和误差校正(一致化)的影响更加明显。对于本研究中使用的 Agilent SureSelectTHS试剂盒，还利用分子条形码进行了单独分析。分子条形码分析使在靶率略有提升(图1)。平均读出序列深度和 20X读出序列深度下的靶标碱基覆盖率均略有下降(图2和图3)。这很可能是因为与参考文献2相比，本实验使用的原始测序深度较低(100X)，同时gDNA 起女量较高(100 ng)。 ( 参考文献 ) ( 1. SureSelectXTHS 靶向序列捕获试剂盒，安捷伦出版号 5991-8165CHCN ) ( 2.使用 Agilent SureSel e ctXTHS 靶向序列捕获工作流程进行超灵敏的癌症液体活检分析。安捷伦出版号 5991-8464ZHCN ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 PR7000-1892 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) ( 2018年4月13日，中国出版 ) 5991-9293ZHCN 摘要外显子组测序和靶向基因组合测序是常用的新一代测序 (NGS) 方法，用于鉴定和表征科研与临床样品（如癌症样本）中的不同基因突变。基因组合靶标设计、实验室处理操作和生物信息学分析等许多因素都会影响变异/畸变检测的灵敏度和准确性。本文展示相同 FFPE 样品在多个供应商的六种不同文库制备试剂盒中得到的对比结果。在 100X 原始测序深度下，Agilent SureSelectXT HS 文库制备试剂盒在四个关键指标上表现出最佳性能，即在靶率、平均读出序列深度、20X 读出序列深度下的靶标碱基覆盖率以及捕获前文库产率。供应商 A 试剂盒在 20X 读出序列深度下的靶标碱基覆盖率和捕获前文库产率两个指标中排名第二；供应商 E 在在靶率和平均读出序列深度两个指标中排名第二。总体来说，Agilent SureSelectXT HS 试剂盒的性能优于评估的其他 5 种试剂盒。前言检测 DNA 样品中出现的遗传变异是基础与临床研究中至关重要的一步。靶向测序和外显子组测序是研究具有复杂突变谱样品（如肿瘤样品）的重要工具。聚焦于与疾病或表型相关的选定基因或基因区域，可使研究人员以更经济的方式进行更深度的测序。在不同的靶标序列捕获工作流程中，杂交型靶向序列捕获可提供极大的灵活性和高质量的测序数据。标准靶标序列捕获工作流程包括捕获前 DNA 文库制备、目标区域的杂交捕获以及捕获后 PCR，以产生足够的测序文库。为最大限度提高杂交捕获效率，捕获前文库必须具有高产率和高复杂度。不同的市售文库制备试剂盒利用不同的酶、试剂和工作流程来优化捕获前文库制备效率。Agilent SureSelectXT HS 文库制备试剂盒专门针对完整样品和 FFPE 样品进行了优化，分析周期为 8 小时，DNA 起始量低至 10 ng。分子条形码功能可准确灵敏地检测低频等位基因变异。最近一项研究表明，SureSelectXT HS 工作流程能够实现高灵敏度（检测极限约为 0.1%）和易定制化的 ctDNA 测序。在本应用简报中，我们对比了六个不同供应商的文库制备试剂盒。由 4 个降解 FFPE 样品制备捕获前文库，然后与 Agilent SureSelect 人全外显子 V6 杂交。在 Illumina HiSeq2500 上对捕获文库进行测序。用多个测序 QC 指标确定这些试剂盒的性能。