乳制品中三聚氰胺检测方案

BiSepM-1100 高效液相色谱系统分析奶粉中三聚氢胺的含量 通微(上海)分析技术有限公司研发部一分析化学实验室 2008年12月5日 前言 三聚氰胺，英文名 Melamine，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。分子量126.15， CAS登录号108-78-1。 三聚氢胺分子结构 三聚氢胺分子结构模型 三聚氰胺呈弱碱性(pKb=8)，，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中(pH 值5.5~6.5)与羟甲基的衍生物进行聚聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。因此在进入人体后，三聚氰胺发生取代反应，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石。 新的BiSepTM-1100 高效液相色谱分析仪将于2009年1月起正式发布，为检验新仪器质量，同时配合目前市场主流需求，美国通微在中国的合资机构——通微(上海)分析技术有限公司的资深研究员使用新BiSepTM-1100进行了三聚氢胺含量分析实验。 一.三聚氢胺标准品实验 (1)实验用溶液： 三聚氰胺标准储备液：准确准取100mg(精确到0.1mg)三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液(50：50)溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL 的标准储备液，于4℃避光保存。 离子对试剂缓冲液：准确称取1.05g柠檬酸和1.08g辛烷磺酸钠，加入约498 mL 水溶解，定容至500ml 备用(实际pH值为2.78，调至3.0)。 标准工作液：用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.8、2、20、40、80ug/mL 的标准工作液 (2)实验条件； 仪器： BiSepTM-1100高效液相色谱仪(试验用机) 色谱柱： C18柱，250 mmx4.6 mm (i.d.)， 5 pm； 流动相：离子对试剂缓冲液-乙腈(90：10)； 流速： 1.0ml/min 柱温：40℃ 检测波长：240nm 进样量：20ul (3)实验结果： ProntoSil C18-AQ 柱， 德国 Bischoff 色谱技术公司提供(下称 BISCHOFF柱)，每个标准工作液连续进样2次； m 8 12 16 20 24 28 32 36 40 min 图1(0.8ug/ml 图222ug/ml mV -90 -80-70-60-50-40-30.20.10 --10 4 88 12 16 20 24 28 32 36 40 min 图320ug/ml 图440ug/ml 图580ug/ml 计算结果：标准曲线图 浓度(ug/ml) 0.8 2 20 40 80 峰面积 65981 172981 1677454 3262153 6709057 图6BISCHOFF柱标准曲线图 Unimicro C18 柱，美国通微技术股份有限公司提供(下称UNIMICRO 柱) 70.8ug/ml 图8 2ug/ml mV -72 -64.56-48-40-32-2416 8 1L --8 8 12 16 20 24 28 32 36 40 min 图920ug/ml mV 图10440ug/ml 图11880ug/ml 计算结果：标准曲线图 浓度(ug/ml) 0.8 2 20 40 80 峰面积 97685 189146 1648902 3503368 6646558 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 y=83242x+39741R=0.9992 图12 UNIMICRO 柱标准曲线图 二、三聚氢胺样品实验 (1)实验用溶液： 三氯乙酸溶液(1%)：准确称取1g三氯乙酸于100ml容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。 (2)样品前处理： 称取2 g试样于50mL离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超声提取30 min，以8000 r/min离心10 min，上清液过滤后待用。 (3)实验条件：同标准实验 (4)实验结果：每个羊品连续进样2次 河南奶业公司样品： 图13 某河南奶业公司奶粉样品检测图 三聚氢胺峰面积： A1=1848771；A2=1787808； AVE=1818289.5 X——试试中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)； A——样液中三聚氰胺的峰面积； 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL)； V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)； Ass—标准溶液中三聚氰胺的峰面积； m—试样的质量，单位为克(g)；ff—稀释倍数 公式计算(用20ug/ml标准样品值代入) BISCHOFF柱： X=1818289.5*20*20*1000/1677454*2*1000=216.8 mg/kg UNIMICRO柱： X=1818289.5*20*20*1000/1648902*2*1000=220.5 mg/kg 代入 BISCHOFF 柱实验线性方程 y=83593x-9903.1 X=(1818289.5+9903.1)/83593=21.9(ug/ml)则样品中的三聚氢胺含量为21.9*20/2=219(ug/g) =219(mg/kg) 代入通微柱实验线性方程y=83242x+39741X=(1818289.5-39741)/83242=21.4(ug/ml)则样品中的三聚氢胺含量为21.4*20/2=214 (ug/g) =214(mg/kg) 施恩奶粉实验结果 图14 施恩奶粉样品检测图 三聚氢胺峰面积：A1=22458；A2=27565； AVE=25011.5 公式计算(用0.8ug/ml标准样品值带入) BICHOFF：X=25011.5*0.8*20*1000/65981*2*1000=3.03 mg/kg UNIMICRO： X=25011.5*0.8*20*1000/97685*2*1000=2.05 mg/kg 代入 BISCHOFF 柱实验线性方程 y=83593x-9903.1X=(25011.5+9903.1)/83593=0.42(ug/ml) 则样品中的三聚氢胺含量为0.42*20/2=4.2(ug/g) =4.2(mg/kg) 代入UNIMICRO 柱实验线性方程y=83242x+39741 (负值无意义)