食品花生中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱柱)

TSKgelTECHNICALINFORMATIONNo.184 LC/MS 及 HPLC法分析花生中黄曲霉毒素 Analysis of Aflatoxins in peanut by LC/MS and HPLC methods 黄曲霉毒素是主要由黄曲霉 (aspergillusflavus) 等霉菌产生的代谢产物，存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米等粮油产品，具有很强的致癌性，是对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。现已鉴定出的黄曲霉毒素大约有20种，其中最典型的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2共计4种(图1)。日本厚生劳动省发布的黄曲霉毒素检测法，是使用免疫亲和色谱柱进行前处理后再采用 LC/MS 法以及荧光衍生-HPLC法进行分析。中国2017年1月发布的最新国家标准 GB 5009.22-2016中新增了同位素稀释液相色谱-串联质谱法。也同样先用免疫亲和柱对样品进行前处理，然后再用 LC/MS 方法检测。 本报告将参照日本的方法，对花生样品的黄曲霉毒素检测进行介绍。 (1)LC/MS 法 花生样品的前处理方法如图2所示。经搅拌机粉碎、萃取、过滤后，采用结合了黄曲霉毒素特异性抗体的免疫亲和色谱柱净化样品，然后直接测定. 分析柱使用 TSKgel ODS-100V 5pm (2.0mml.D. x150 mm， 5 um)， 将乙酸铵水溶液、乙腈以及甲醇的混合溶剂作为流动相进行分离。检测法列出了选择性离子监测(SIM)以及选择性反应监测(SRM)的检测条件，此次采用 SIM 进行检测。将总黄曲霉毒素浓度添加至检测限量值的2倍(20 pg/kg) 的花生作为样品，进行前处理后，通过 LC/MS 法进行测定，色谱图如图3所示。 图1黄曲霉毒素的结构式 样品 50g +乙乙/水(9/1)100mL 搅拌机拌5分钟 离心分离(2500 r/min， 5分钟) 分取萃取液5mL +磷酸缓冲生理盐水定容至50 mL过滤(玻璃纤维滤纸) 滤液10mL 免疫亲和色谱柱提纯 +清洗；磷酸缓冲液 10mL +清洗；水10mL +洗提；加压除去水分后，乙腈3mL 洗提液乙腈 5mL定容 烟棍溶液 1mL 减压浓缩干固 +流动相1ml LC/MS 表1分析条件 色谱柱： TSKgel ODS-100V 5pm (2.0 mml.D.x 150 mm， 5 pm) 流动相： CH3OH/CH3CN/10 mmol/L CH3COONH4=60/20/150 流速：0.2 mL/min 柱温：40C 进样量：10uL MS： G1956B (Agilent Technologies) 离子源： ESI(+) 模式： SIM m/z： AflatoxinB1 313 AflatoxinB2 315 AflatoxinG1 329 AflatoxinG2 331 Peak 1 1500 图3花生样品的色谱图 (LC/MS 法) 添加浓度：总黄曲霉毒素量为 20 pg/kg (检测限量值的2倍) (2)荧光衍生-HPLC 法 花生样品的前处理方法如图4所示。样品的粉碎、萃取、过滤处理以及使用免疫亲和色谱柱净化都按图2进行相同处理。黄曲霉毒素有天然荧光，无须衍生化即可检测出荧光。为增强黄曲霉毒素B1和G1的荧光强度，使用 TFA 将其衍生为氢氧化物。此外，黄曲霉毒素B2和G2未进行衍生化。 分析柱使用 TSKgel ODS-100V 5pm (4.6mml.D. x250 mm， 5 pm)，以水、乙腈以及甲醇的混合溶剂作为流动相进行分离。将总黄曲霉毒素浓度添加至检测限量值的2倍(20pg/kg)的花生作为样品，进行图4所示的前处理后，采用 HPLC 法进行测定，色谱图如图5所示。因为衍生为氢氧化物，黄曲霉毒素的洗脱顺序与图3中有所不同。 样品 50g +乙乙/水(9/1) 100 mL搅合器搅拌5分钟 离心分离(2500 r/min， 5分钟) 分取萃取液5mL +磷酸缓冲生理盐水定容至 50 mL 过滤(玻璃纤维滤纸) 滤液 10mL 免疫亲和色谱柱提纯 +清洗；磷酸缓冲液10mL +清清洗；水10mL +洗提；加压除去水分后，乙腈3mL 洗提液乙腈5mL定容 洗提液1mL 减压浓缩干固 +TFA0.1mL 使用试管搅拌器搅拌，室温阴凉处静置15分钟+乙乙/水(1/9)0.9mL 试管搅拌器混合 HPLC 表2分析条件 图5花生样品的色谱图(荧光衍生化-HPLC法)添加浓度：总黄曲霉毒素量为20 pg/kg(检测限量值的2倍) 两种分析方法的黄曲霉素定量范围、重现性、定量限界以及回收率如表3所示。 根据标准样品制成的校准曲线结果显示，LC/MS 法结果在 0.25~10 pg/L、荧光衍生化-HPLC法结果在1.0~4.0 pg/L 的浓度范围内，可得到相关系数 r2=0.999 以上的良好线性关系。 两种方法的定量下限值(LOQ)均为约0.1ug/L， 根据检测法前处理时相当于1 pg/kg(限量值的1/10浓度)。将各黄曲霉毒素标准物质浓度分别添加至 5 ug/kg 的花生作为样品，测定的回收率为98.7~110%，结果良好。         黄曲霉毒素是主要由黄曲霉（ aspergillus flavus）等霉菌产生的代谢产物，存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米等粮油产品，具有很强的致癌性，是对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。现已鉴定出的黄曲霉毒素大约有20 种，其中最典型的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 共计4 种。日本厚生劳动省发布的黄曲霉毒素检测法，是使用免疫亲和色谱柱进行前处理后再采用LC/MS 法以及荧光衍生-HPLC 法进行分析。              中国2017 年1 月发布的最新国家标准GB 5009.22-2016 中新增了同位素稀释液相色谱-串联质谱法。也同样先用免疫亲和柱对样品进行前处理，然后再用LC/MS 方法检测。        本报告将参照日本的方法，对花生样品的黄曲霉毒素检测进行介绍。