食品中真菌毒素检测方案(液质联用仪)

作者 摘要 Elisabeth Varga、 Franz Berthiller、Rudolf Krska 和 Michael SulyokChristian Doppler 毒枝菌素代谢实验室与分析化学中心，农业生物技术系(IFA-Tulln)， 自然资源与生命科学大学 (BOKU)，奥地利维也纳 Emma Rennie 安捷伦科技有限公司 Santa Clara， CA， USA Thomas Glauner 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany 利用 Q-TOF LC/MS 和精确质量谱库筛查并验证食品中的真菌毒素 应用简报 食品与农业 本应用简报介绍了真菌毒素及相关代谢物精确质量谱库的创建及其在食品中真菌毒素筛查领域的应用。与 Agilent 1290 Infinity 液相色谱联用的 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS在正离子和负离子电喷雾模式下运行，系统采用双电喷雾安捷伦喷射流技术。在一种或两种离子化模式下采集大量真菌毒素及相关代谢物的精确质量数谱图，并采集所有相关离子形态的精确质量数谱图。 对有44种指示物加标的三种不同基质进行萃取。在靶向 MS/MS 和全离子 MS/MS 采集模式下对样品进行分析。本研究证明了两种采集模式与高效数据分析工作流程和真菌毒素及相关代谢物个人化合物数据库与谱库 (PCDL)联用，对复杂基质中真菌毒素筛查和验证的价值。 真菌毒素是真菌的次生有毒代谢物，可能存在于谷物、坚果、水果、香料和咖啡等各种食品和饲料中[1]。它们可能对人和动物产生肝毒性、致突变、致癌、雌激素或免疫抑制作用。数百种真菌毒素及次生真菌代谢物分别属于不同的化学类别，理化特性差异极大。目前，仅有大约十二种真菌毒素被认为具有严重的健康危害，并在食品和饲料中受到监管。在欧洲，欧盟委员会法规(EC)1881/2006及其修正案规定了食品中黄曲霉毒素、呕吐毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素A、展青霉素和玉米赤霉烯酮的最高限量[2]。此外，欧盟委员会建议 2013/165/EU 中还规定了T-2和HT-2毒素的指示性含量[3]。 能够证明受监管化合物以外的真菌毒素存在的综合数据非常有限，对于原谷物以外的食品基质更是如此[4]。这是近年来真菌毒素单一分析方法逐渐被基于LC/MS的多目标分析方法取代的原因之一[4，5]。不同产品分析方法的融合、不同复杂基质中真菌毒素的鉴定以及增进对曲霉属、青霉属、镰刀菌属或链格孢属真菌中新兴真菌毒素的了解只是引导这一趋势的几个原因。近年来现代液质联用仪的性能改进以及有助于提升分析效率的软件工具的开发促进了这一趋势的发展。现代高分辨率精确质量 LC/Q-TOF 仪器能够分析几乎无限数量的污染物[6]。它们还支持通过回顾性数据分析来查找在测定时未予考虑的污染物[7]。 尽管开发出的多数多目标方法主要用于筛查污染物，但它们也可采集受监管真菌毒素的定量信息。挑战在于需要从众多食品中高效萃取出理化特性差异极大的分析物，并且天然存在的毒素浓度差异极大。 本应用简报介绍了精确质量 LC/MS/MS数据库和谱库的创建与应用。该谱库包包300多种适合采用 LC/MS进行分析的真菌毒素及真菌或细菌代谢物，可用于对食品样品中的这些化合物进行筛查和鉴定。样品前处理方法包括采用酸化的乙乙-水混合液进行单次萃取。方法中采用两种不同的筛查策略。在传统方法中，Q-TOF 液质联用系统首先在 TOF模式下运行，并进行数据库搜索。借助第二次进样，采用靶向MS/MS方法分析疑似分析物列表并将获得的谱图与 MS/MS谱库进行比较。在第二种方法中，Q-TOF在具有两种碰撞能量的全离子 MS/MS模式下运行。全离子技术能够轻松设置采集方法并使用 MS/MS谱库对真菌毒素进行验证。该方法可使母离子和子离子在色谱中实现共流出。我们展示了用于分析玉米、榛子和葡萄酒中44种代表性指示物的方法性能参数。 实验部分 试剂和标准品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 或 LC/MS级。乙腈、甲醇和甲酸购自 VWR International(奥地利维也纳)。甲酸铵溶液(部件号G1946-85021)来自安捷伦。超纯水产自 Purelab Ultra 系统 (ELGALabWater，德国策勒)。真菌与细菌代谢物的分析标准品购自Enzo Life Sciences (瑞士洛桑)、Bioviotica Naturstoffe GmbH(德国德兰斯费尔德)、Bioaustralis (由德国 Tebu-Bio经销)、Iris Biotech GmbH (德国马克特雷德维茨)、Romer Labs (奥地利图尔恩)或 Sigma-Aldrich (奥地利维也纳)。其他标准品以分离菌形式由世界各地的研究团队提供。 标准储备溶液的配制方法为根据物质的理化特性不同，将参比化合物溶解于乙腈、甲醇、水或其混合物中。将单独的标准溶液混合制成多组分工作溶液，用于校准和空白样品加标。标准储备溶液与多组分工作作液在使用前于-20°℃下储存。用乙腈：水：甲酸(79：20.9：0.1， v：v：v)的混合液稀释工作溶液以制得校准样品。萃取溶剂具有相同的成分。 样品前处理 购得用于加标实验的空白玉米和榛子样品后，利用 LC/MS/MS方法检验其中是否不存在任何目标化合物。采用电动搅拌机将样品磨碎并混匀。称取5g(±0.01g)样品至50mL聚丙烯管中，并加入20mL萃取溶剂。将样品置于旋转摇床上，于室温下萃取90分钟。当固体残余物沉淀完全后，将萃取液转移至 HPLC 样品瓶中。向该萃取液中加入三种不同浓度的多组分工作溶液。 LC/MS/MS分析 采用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 进行分离，该系统包括： Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A)、Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器(G4226A)以及Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) ( 该 UHPLC系统与配备双电喷雾安捷伦喷射流电喷雾离子源的 Agilent 6550 iFunnel 四极杆飞行时间质谱联用。用在 1.0 mL/min下运行的 Agilent 1260 Infinity 等度泵 (G1310B)以及1/100分流 器(部件号 G1607-60000)输送参比质量离子。参比雾化器的最 终流速为 10pL/min。采用 B .05 . 01 版 Agilent MassHunter 数据 采集软件操作 Q-TOF液质联用仪，在两种不同方法中分别采用正离子化或负离子化模式在2 GHz 的扩展动态范围模式下运行。在靶向 MS/MS采集中，在MS 和MS/MS模式下采用三次扫描/秒的数据采集速率。全离子MS/MS采集使用三次扫描/秒的采集速率和两个不同的碰撞能量。使用两种碰撞能量得到包含母离子的低能量通道以及包含母离子和子离子的两个高能量通道的交替谱图。 ) 色谱条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18， 2.1×100 mm， 2.7 pm (部件号 695775-902) 流动相： A)5 mM甲酸铵+0.1%甲酸 B)5 mM甲酸铵+0.1%甲酸的甲醇溶液 时间(min) %B 10.0 15.0 15.1 17.0 停止时间： 17.0 min 柱温： 30°C 流速： 0.40 mL/min 进样量： 2pL 双 AJS条件 干燥气温度： 130°C 干燥气流速： 16 L/min 雾化器压力： 30 psig 鞘气温度： 300°C 鞘气流量： 11L/min 毛细管电压： +ve 4000 V； -ve 4000 V 喷嘴电压： +ve 500 V； -ve 500 V 参比质量校正： +ve 121.05087 和922.00980； -ve 112.98559 和966.00073 全离子 MS/MS 质量范围： 40-1300 amu 扫描速率： 3幅谱图/秒 碰撞能量： 0-10-40V 靶向 MS/MS MS质量数范围： 80- 1300 amu MS/MS质量数范围： 40-1300 amu 扫描速率： MS 和 MS/MS均为3幅谱图/秒 碰撞能量： 20V 目标质量数： 45(正离子和负离子)， △RT 0.5 min 使用 MassHunter定性分析软件 B.07.00评估数据。如果通过分子式查找数据挖掘算法检出的化合物的质量误差低于 5 ppm 并且具有足够高的得分(包括同位素丰度和同位素质量间距)，则真菌毒素的鉴定结果将报告为阳性。为峰检测指定±1分钟的保留时间窗口以补偿由系统之间变异性引起的保留时间漂移。 真菌毒素及相关代谢物 PCDL的创建 在碰撞能量分别为10 eV、20 eV和40 eV的靶向MS/MS模式下，通过流动注射或使单一分析物溶液通过短柱来采集精确质量数谱图。利用所有相关化合物化态(包括[M+H]+、[M-H]一、[M+NH]+和[M+HCOO]-) 作为目标质量。如果母离子稳定性较高，需要采用较高的碰撞能量，则在第二次运行中采集额外谱图。在正离子化或负离子化模式下，可采集到300多种真菌毒素及其他真菌或细菌代谢物的有意义的 MS/MS 谱图。对于若干种化合物，在两种离子化模式下采集得到了一种以上母离子形态的MS/MS 谱库谱图。研究人员在过去十多年中收集到了各种固体标准品或储备溶液。多数化合物购自不同供应商，除此之外的化合物是从 BOKU 的IFA-Tulln 中分离得到或由其他研究团队提供。 为消除质量分配误差，将所采集谱图中的碎片离子质量与理论碎片分子式进行比较，并根据其理论质量数对其进行校正。所有MS/MS谱图均经过谱图噪音修正。采用最低基峰阈值以确保得到所有碎片离子均获得良好的离子统计数据。经校正的谱图包含在安捷伦真菌毒素及相关代谢物个人化合物数据库与谱库(部件号 G5883CA)中，这些谱图可用于筛查与验证食品样品中的真菌毒素。对于44种指示物，通过给定的HPLC 方法分析全套真菌毒素标准品，以将其保留时间信息添加至谱库中。 图1显示了 MassHunter PCDL Manager 软件的屏幕截图，以及在10 eV 的碰撞能量下采集得到的T-2毒素[M+NH，]+形态的精确质量数谱图。 图1. Agilent MassHunter PCDL Manager 软件中的真菌毒素及相关代谢物 PCDL 以及10 eV的碰撞能量下采集得到的 T-2毒素的[M+NH]*形态的精确质量数谱图 利用全离子MS/MS采集模式进行同步筛查和验证向玉米和榛子萃取液以及红酒中加入选自真菌毒素及真菌代谢物组中的44种指示物。选择所有受监管化合物、·一些极性和非极性分析物以及不易电离的化合物。在全离子MS/MS工作流程中，无需低能量通道中的碎裂即可采集到精确质量数据。同时，在未经过母离子选择的条件下利用两种不同的碰撞能量使化合物碎裂。在两个高能量通道中记录精确质量碎片数据。采用分子式查找算法对数据进行分析时，母离子信息来自真菌毒素及相关代谢物PCDL， 并提取所有指定离子形态的化合物色谱图。在推断鉴定中，使用 PCDL 中存储的谱图，并从高能量通道中自动提取指定数量的最高丰度碎片离子色谱图。例如，图2A显示了真菌毒素及相关代谢物PCDL 中的曲霉亚亚胺的精确质量谱库谱图，并与加标 图 2.40 eV碰撞能量下得到的曲霉酰亚胺的精确质量谱库谱图 (A)与加标玉米样品采集得到的高能量谱图(干净谱图)(B)的比较。谱库谱图中的红色三角形表示自动选择用于全离子 MS/MS评估的离子 玉米样品获得的高能量干净谱图(图2B)进行了比较。红色三角形指示自动从谱库谱图中选择的碎片离子，以便进行评估。尽管谱库谱图基于 40 eV的碰撞能量，但高能量干净谱图中结合了10 eV和40 eV 下两个高能量通道采集到的信息。 通过叠加母离子和碎片离子的色谱图并计算共流出得分对真菌代谢物曲霉酰亚胺的鉴定结果进行确证。共流出得分需考虑到丰度、峰形(对称性)、峰宽和保留时间等因素。对得分进行绘图，以便在共流出曲线中进行检查。图3A显示了高能量通道下得到的母离子色谱图与碎片离子色谱图的叠加图。在自动提取的碎片离子中，六个碎片的离子色谱图显示出了与母离子的共流出，如图3B中的共流出曲线所示。图3C则显示了化合物表中的详细鉴定结果。 图3.加标玉米样品中曲霉酰亚胺母离子和碎片离子的叠加谱图(A)、共流出曲线(B)以及包括共流出得分的化合物鉴定结果(C) 表1列出了以 30 ng/mL 浓度加标至玉米提取物中的所有44种真菌毒素及真菌代谢物。在正离子化或负离子化模式下对这些化合物进行了测定，并给出了每种分析物的主要形态。对几种化合物在两种极性模式下进行检测和定性分析。对于这种情况，表中列出了在灵敏度更高的电离模式下得到的结果。在上述浓度下，采用分子式查找算法通过自动搜索检测到多数化合物。测定的质量数与理论质量数的质量偏差相比，通常小于1 ppm。质量偏差在2-5ppm 之间的仅有11种化合物。因此，包括保留时间、质量准确度、同位素丰度和同位素质量间距在内的目标得分基本都在90以上(总分100)。在正离子或负离子模式下通过一个以上的额外碎片离子对多数化合物进行验证。将80分(总100)的最低共流出得分指定为化合物验证标准。 图4显示了加标至玉米提取物的T-2毒素的化合物色谱图和峰谱图。T-2毒素的主要离子形态为[M+NH]+和[M+Na]+离子。这些离子形态测定的m/z信号(蓝色)与预期同位素比(红色方框)呈现出良好的一致性。软件总共将10个离子归属为T-2毒素的[M+H]+、[M+NH]+和[M+Na]+形态，其中包括其同位素信号。高达98.5的目标得分(总分100)反映出了良好的质量准确度和同位素模式匹配结果。其他化合物的目标得分(未列出)与表1中全离子 MS/MS工作流程得到的值相当。 红色菱形表明MS/MS谱图在该 m/z 下采集。自动提取整个峰范围内的 MS/MS 谱图， 并与 PCDL 中包含的谱库谱图进行了匹配。 通过靶向 MS/MS 集集模式筛查并验证食品中的真菌毒素 研究中还采用同一个色谱方法(但采用靶向MS/MS采集)对相同样品进行了分析。利用真菌毒素及相关代谢物 PCDL 与分子式查找数据挖掘算法相结合来查找化合物。系统将自动提取已鉴定化合物的预期离子形态色谱图、MS 和MS/MS 谱图。根据单一同位素精确质量数、同位素比、同位素质量间距和保留时间的一致性对结果进行评分。 图4.通过分子式查找算法获得的加标浓度为 30 ng/mL 的玉米样品的T-2毒素的化合物色谱图(A)和质和峰谱图 (B) 表1.玉米萃取液中加标浓度为 30 ng/mL 的44种真菌毒素及真菌代谢物的分析结果，采用正离子化或负离子化全离子MS/MS 采集模式进行测定 离子形态 质量数 质量数偏差(ppm)目标得分 共流出得分 图5显示了在加标浓度为 30 ng/mL 的玉米提取物中采集到的 T-2毒素的 MS/MS谱图(上图)与 PCDL 中谱库谱图(下图)的比较。中图为差异谱图的镜像显示。在20 eV的碰撞能量下，T-2毒素谱库谱图中的所有主要碎片离子均在测定的谱图中检出，碎片离子处于较窄的质量提取窗口内，并与参比谱图具有相似的比值。因此，在精确质量谱库中的反向搜索得到了91.7的分数(总分100)，验证了T-2毒素在样品中的存在。详细的化合物鉴定结果显示于图6的化合物表中。所有单个化合物的 MS/MS 得分均未示出，但实现验证的化合物得分均高于60分(参参图7). 两种工作流程的比较 对加标食品萃取液进行真菌毒素及真菌代谢物的精确质量筛查，并通过 MS/MS 谱库搜索或全离子 MS/MS 采集对已鉴定的污染物进行验证。图7显示了加标浓度为30 ng/mL 的三种不同基质在两种采集模式下得到的结果对比。一般来说，红酒表现出较强的抑制效应，导致其检出率和验证率低于其他基质。靶向 MS/MS采集与单一碰撞能量和谱库匹配相结合，得到了与具有碎片共流出的全离子 MS/MS 采集相近的验证率。特别需要指出的是，与全离子 MS/MS碎裂模式相比，母离子分离对更复杂的基质和较低质量数污染物的鉴定能力得到了提高。相反，全离子 MS/MS采集速度极快，并能够区分麦角生碱和异麦角生碱等邻近流出的异构体。 图5.加标玉米提取物中T-2毒素的测定谱图与安捷伦真菌毒素及相关代谢物 PCDL 中的参比谱图的比较 图6.加标玉米样品中T-2毒素的化合物鉴定结果，包括质质图的质量准确度和同位素信息以及 MS/MS谱图比较 碎片共流出得到验证的化合物 未通过FBF检出的化合物 图7.采用靶向 MS/MS 采集结合谱库搜索或全离子 MS/MS 采集得到的三种不同基质中浓度为 30 ng/mL 的真菌毒素及真菌代谢物的筛查和验证结果。绿色：通过MS/MS谱库匹配或碎片离子共流出自动检出并且存在得到验证的化合物；黄色：自动检出但未采集到定性 MS/MS谱图的化合物 实际样品的分析 除分析加标基质外，还根据所述方法对受污染的榛子样品进行了萃取，并将萃取物进样至 Q-TOF液质联用系统，采用全离子MS/MS在正离子和负离子模式下进行分析。将全离子 MS/MS评估出的校准样品的母离子和碎片离子信息导出至 MassHunter定量分析软件以快速创建定量数据处理方法。数据处理完成后，在化合物概览模块中按样品和化合物查看结果。图8显示了在榛子样品中作为污染物检出的六种真菌代谢物的色谱图。在负离子模式下检测到交链孢酚、交链孢霉甲基醚、玉米赤霉烯酮和巨孢子素。在正离子模式下检测到了 Brevianamid F 和霉酚酸。对于所有化合物，母离子 m/z 和至少一个碎片离子的质量偏差应小于5ppm， 才能满足鉴定化合物的要求。 本文所介绍的方法包括快速、简便而经济的溶剂萃取以及后续将稀释的原萃取液进样至UHPLC/Q-TOF/MS 系统进行分析的步骤。该方法充分利用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统的低延迟体积及其能够在 UHPLC分离中承受高反压的优势，从而提高了色谱分离度。该方法得益于 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 的高灵敏度以及安捷伦喷射流离子源的通用电离功能。 研究中创建了真菌毒素及相关代谢物的精确质量 PCDL 并将其应用于食品样品中真菌毒素的筛查和验证。通过分析含有44种真菌代谢物的食品样品对靶向 MS/MS 和全离子 MS/MS采集模式进行了评估。两种采集模式分别与 Agilent MassHunter软件以及独有的内置鉴定标准相结合，可有效验证样品中存在的真菌毒素。尽管靶向 MS/MS信息对于低分子量化合物更加可靠，但全离子MS/MS数据可在随后对初次测定时不在分析范围内的化合物进行重新解析。为实现高效数据审查，研究中采用了定量分析软件。该软件能够显示定量离子和定性离子，包括质量准确度、定性离子比、谱库匹配得分和保留时间匹配等质量标准。 该方法是单一分析物或分析物组检测方法的适当补充，有助于对各种食品中真菌毒素的存在状况加以了解。 图8.天然受污染的榛子样品中检出的真菌毒素色谱图。(A) Brevianamid F (  摘要    本应用简报介绍了真菌毒素及相关代谢物精确质量谱库的创建及其在食品中真菌毒素筛查领域的应用。与Agilent 1290 Infinity 液相色谱联用的Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS在正离子和负离子电喷雾模式下运行，系统采用双电喷雾安捷伦喷射流技术。在一种或两种离子化模式下采集大量真菌毒素及相关代谢物的精确质量数谱图，并采集所有相关离子形态的精确质量数谱图。对有44 种指示物加标的三种不同基质进行萃取。在靶向MS/MS 和全离子MS/MS 采集模式下对样品进行分析。本研究证明了两种采集模式与高效数据分析工作流程和真菌毒素及相关代谢物个人化合物数据库与谱库(PCDL) 联用，对复杂基质中真菌毒素筛查和验证的价值。    前言    真菌毒素是真菌的次生有毒代谢物，可能存在于谷物、坚果、水果、香料和咖啡等各种食品和饲料中[1]。它们可能对人和动物产生肝毒性、致突变、致癌、雌激素或免疫抑制作用。数百种真菌毒素及次生真菌代谢物分别属于不同的化学类别，理化特性差异极大。目前，仅有大约十二种真菌毒素被认为具有严重的健康危害，并在食品和饲料中受到监管。在欧洲，欧盟委员会法规(EC)1881/2006 及其修正案规定了食品中黄曲霉毒素、呕吐毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素A、展青霉素和玉米赤霉烯酮的最高限量[2]。此外，欧盟委员会建议2013/165/EU 中还规定了T-2 和HT-2 毒素的指示性含量[3]。     能够证明受监管化合物以外的真菌毒素存在的综合数据非常有限，对于原谷物以外的食品基质更是如此[4]。这是近年来真菌毒素单一分析方法逐渐被基于LC/MS 的多目标分析方法取代的原因之一[4,5]。不同产品分析方法的融合、不同复杂基质中真菌毒素的鉴定以及增进对曲霉属、青霉属、镰刀菌属或链格孢属真菌中新兴真菌毒素的了解只是引导这一趋势的几个原因。近年来现代液质联用仪的性能改进以及有助于提升分析效率的软件工具的开发促进了这一趋势的发展。现代高分辨率精确质量LC/Q-TOF 仪器能够分析几乎无限数量的污染物[6]。它们还支持通过回顾性数据分析来查找在测定时未予考虑的污染物[7]。    尽管开发出的多数多目标方法主要用于筛查污染物，但它们也可采集受监管真菌毒素的定量信息。挑战在于需要从众多食品中高效萃取出理化特性差异极大的分析物，并且天然存在的毒素浓度差异极大。    结论    本文所介绍的方法包括快速、简便而经济的溶剂萃取以及后续将稀释的原萃取液进样至UHPLC/Q-TOF/MS 系统进行分析的步骤。该方法充分利用Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统的低延迟体积及其能够在UHPLC 分离中承受高反压的优势，从而提高了色谱分离度。该方法得益于Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 的高灵敏度以及安捷伦喷射流离子源的通用电离功能。    研究中创建了真菌毒素及相关代谢物的精确质量PCDL 并将其应用于食品样品中真菌毒素的筛查和验证。通过分析含有44 种真菌代谢物的食品样品对靶向MS/MS 和全离子MS/MS 采集模式进行了评估。两种采集模式分别与Agilent MassHunter 软件以及独有的内置鉴定标准相结合，可有效验证样品中存在的真菌毒素。尽管靶向MS/MS 信息对于低分子量化合物更加可靠，但全离子MS/MS 数据可在随后对初次测定时不在分析范围内的化合物进行重新解析。为实现高效数据审查，研究中采用了定量分析软件。该软件能够显示定量离子和定性离子，包括质量准确度、定性离子比、谱库匹配得分和保留时间匹配等质量标准。    该方法是单一分析物或分析物组检测方法的适当补充，有助于对各种食品中真菌毒素的存在状况加以了解。