血清中青霉素，阿莫西林等18种抗生素检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 LC-MS-MS法同时检测血清中18种抗生素 贺海波，黄德凤b，潘志峰。 沃特世科技华东区应用技术服务；沃特世科技亚太区应用技术服务；上海溯源生物技术有限公司 简介 抗生素在生活中的应用十分广泛，在人体内长时间残留可对人类，尤其是婴幼儿的生长发育产生各种不利的影响。食品中抗生素的残留，已经成为食品安全领域的一个重要问题，相关部门已经有诸多针对性的前处理及检测方案。然而，人体内的抗生素检测方法，尤其是多种不同抗生素同时检测的方法，却鲜有提及。本文使用一种简单快捷的前处理方法，结合沃特世液质联用技术，可对人血清中常见的不同类型的抗生素进行同时处理并检测。 本文建立了青霉素类(青霉素，阿莫西林，氨苄西林，苯唑西林)，四环素类(四环素，金霉素，土霉素)，喹诺酮类(左氧氟沙星，环丙沙星，诺氟沙星)，磺胺类(磺胺吡啶，磺胺嘧啶，磺胺噻唑，磺胺二甲嘧啶)，头孢类(头孢噻肟，头孢噻吩)，林可霉素和氯霉素，共7类18种抗生素在人血清中的前处理和LC-MS/MS分析检测方法。 使用Oasis HLB pElution plate 30 pm对血清样品进行前处理，具体步骤如下： Oasis HLB pElution plate活化：取200pL甲醇加入Oasis HLB pEluting Plate小孔，负压抽滤；用200pL超纯水冲洗并抽滤两次；废液遗弃。 样品准备：取120pL血清样品，加入120pL磷酸溶液(4%)，涡旋混匀1 min。 上样：取上述溶液200pL(相当于100pL血清样品)， 加入Oasis HLBpEluting Plate， 负压抽滤，废液遗弃。 冲洗：加入100uL超纯水冲洗并抽滤，之后重复冲洗抽滤一次，废液遗弃。 洗脱：加入50uL60%乙洗洗脱并抽滤，之后重复洗脱抽滤一次；用96孔板合并收集洗脱步骤的两次洗脱液。 进样：上述洗脱液直接进样，进样量5uL。 进样量： 5pL 时间 流速 梯度 (min) (mL/min) A% B% 曲线 初始 0.4 95 5 一 0.2 0.4 95 5 6 5.0 0.4 10 90 6 6.0 0.4 10 90 6 6.1 0.4 95 5 6 8.0 0.4 95 5 6 表1.流动相洗脱程序。 质谱条件质谱系统： Xevo TQD离子化方式： ESI毛细管电压： 3.0kV(ESI+)， 2.5kV(ESI-)离子源温度： 150°C脱溶剂气温度： 550°C脱溶剂气流速： 1000L/h MRM离子对信息。 实验结果 标准工作曲线最低点各化合物的色谱图 7： MRM of 2 Channels ES+ TIC (Penicillin) 5.064.73e4 TTTT TT UT T3.50 4.00 4.50 5.00 5.506.00 6.50 7.00 7.50 8.0010： MRM of 2 Channels ES+2.62 TIC (Amoxicilin) 2.648.53e4 TUTTT-0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.0020170616_003 8： MRM of 2 Channels ES+3.65 TIC (Ampicillin)氨苄西林 3.10e5 T6.50 7.00 7.50 8.00 -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.0020170616003 11： MRM of 2 Channels ES+5.33 TIC (Oxacillin)苯唑西林 6.51e4 0- T T TTT4 TT TTTT T丽 TTTT-0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.0020170616003 14： MRM of 2 Channels ES+3.55 TIC (Tetracycline)100- 四环素 6.89e4 8-0- TI TTU TTU-0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.0020170616003 20：MRM of 2 Channels ES+4.18 TIC (Chlortetracycline)100= 金霉素4.028.53e3 28-O--0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.0020170616003 17： MRM of 2 Channels ES+3.61 TIC (Oxytetracycline)100 土霉素 2.40e4 ：80-4.12-0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.0020170616_003 9： MRM of 2 Channels ES+3.41 TIC (Olfoxacin) 100 881左氧氟沙星 1.67e5 0- 川-0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.0020170616_003 6： MRM of 2 Channels ES+3.55 TIC (Ciprofloxacin) 100= 1.03e6081 环丙沙星 0- Time-0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 接上图 标准工作曲线线性与加标回收率考察 标准曲线和回收率样品是通过前加标的方式，将标准溶液1：20加入到空白血清中，按照前面描述的血清样品前处理方法进行化合物提取，并上样分析；线性浓度范围根根实际应用需要设定。 用于回收率计算的样品平行处理4份，分别记为I，Ⅱ，ⅢI和I；-：结果异常，不参与计算。 编号 化合物 线性范围 R2 回收率(%) ng/mL 1 III IV Mean CV(%) (%) 1 青霉素 Penicillin 2~40 0.9936 100.1 95.0 89.1 114.8 99.8 11.02 2 阿莫西林 Amoxicilin 2~200 0.9964 115.5 113.2 136.9 128.3 123.5 9.03 3 氨苄西林 Ampicillin 2~200 0.9992 106.1 109.0 115.0 126.9 114.3 8.06 4 苯唑西林 Oxacillin 2~200 0.9974 100.7 93.9 93.4 114.1 100.5 9.59 5 四环素 Tetracycline 4~80 0.9984 96.2 105.3 101.7 101.3 101.1 3.70 6 金霉素 Chlortetracycline 10~1000 0.9998 105.0 107.1 108.6 108.8 107.4 1.64 7 土霉素 Oxytetracycline 10~200 0.9948 98.7 110.3 116.0 100.3 106.3 7.75 8 左氧氟沙星 Olfoxacin 2~100 0.9972 104.2 104.9 107.6 109.1 106.5 2.16 9 环丙沙星 Ciprofloxacin 10~200 0.9908 100.7 113.9 99.5 100.5 103.7 6.61 10 诺氟沙星 Norfloxacin 10-200 0.9968 104.1 107.7 113.6 116.6 110.5 5.11 11 磺胺吡啶 Sulfapyridine 10-1000 0.9988 111.6 129.0 124.4 140.6 126.4 9.49 12 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 20-500 0.9938 119.4 111.7 112.7 126.4 117.6 5.80 13 磺胺噻唑 Sulfathiazole 50-1000 0.9970 113.3 107.3 108.4 105.3 108.6 3.13 14 磺胺二甲嘧啶 Sulfadimidine 2-40 0.9920 100.7 99.1 100.8 122.6 105.8 10.61 15 头孢噻吩 Cephalothin 10-200 0.9906 115.0 108.8 109.2 - 111.0 3.13 16 头孢噻肟 Cefotaxime 20-200 0.9934 96.9 106.1 106.4 116.8 106.6 7.63 17 林可霉素 Lincomycin 2-100 0.9962 107.9 109.0 109.5 109.9 109.1 0.79 18 氯霉素 Chloramphenicol 0.5-10 0.9968 107.3 91.7 87.9 82.4 92.3 11.58 总结与讨论 不同种类的抗生素具有不同的性质，在食品安全检测中，各类抗生素由于自身化学性质的差异较大，分别有各自不同的提取方法和流程，血清中抗生素的提取方法也鲜有提及，故建立能同时提取不同种类的抗生素的前处理方法成为本实验的一个难点； 每份血清样本能提供的量只有200uL左右，远远小于食品安全检测中每个样本可用的基质量(数克)，因此很难通过前处理对抗生素浓度进行浓缩，低含量的抗生素的检测方法成为本实验的第二个难点。 本实验通过沃特世的Oasis HLBpElution plate 30 um对血清样品进行处理，一次前处理，解决了不同种类的抗生素在血清中的提取回收问题，使不同类型的抗生素的同时检测成为可能。 在前处理过程中，血清中添加磷酸溶液(4%)是为了克服四环素类的蛋白结合，提高其回收效率。同时，在短时间内即通过冲洗(前处理步骤4)，去除磷酸，不会对酸不稳定的青霉素类的回收产生影响。 在SPE plate 选择过程中，曾尝试用Oasis prime HLB pElution plate 30 pm来进行保留-提取，但是青霉素类在该种SPE板上无法很好的保留，导致青霉素类回收率极低，而Oasis HLB uElution plate 30 um对所列各种抗生素均具有一定的保留能力，利用保留-洗脱机制，在基质量较少且无法稀释处理的情况下，可以将样品进行较好的净化。 根据回收率的CV值可见，该前处理方法稳定可重现，血清中的多种不同类型的抗生素皆可以达到90%以上的回收率，数据稳定重现，样品前处理方法简便快速，显著提高了工作效率。 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 上海：021-61562666 广州：020-28296555 成都：028-67653588 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676WWW.waters.com LC-MS-MS法同时检测血清中抗生素 本文建立了青霉素类(青霉素，阿莫西林，氨苄西林，苯唑西林)，四环素类(四环素，金霉素，土霉素)，喹诺酮类(左氧氟沙星，环丙沙星，诺氟沙星)，磺胺类(磺胺吡啶，磺胺嘧啶，磺胺噻唑，磺胺二甲嘧啶)，头孢类(头孢噻肟，头孢噻吩)，林可霉素和氯霉素，共7类18种抗生素在人血清中的前处理和LC-MS/MS分析检测方法。