乳制品中核苷酸检测方案(凝胶色谱仪)

TSK-GEL Application Data Sheet 核苷酸的分离(1)9 TSK-GEL 色谱柱应用数据集((1) 一食品成分·食品添加剂 TSK-GEL 色谱柱应用数据集(1) 一食品成分·食品添加剂一 目录 前言 随着食品生产、加工及保存技术的飞跃发展，我们可以享受到丰富多彩的饮食生活。然而肥胖、生活习惯病(成人病)等的增加，让人们越来越意识到健康的重要性，同时也越来越多地关心食品中所包含的营养成分和食品的安全问题。 近些年来，食品成分、食品添加剂以及食品中残留化学物质的分析方法迅速发展，增加了对开发更为准确且更为简便的分析方法的需求。HPLC 作为满足这些要求的分析法之一，已经在多数食品分析法中得以应用和普及。 本数据集是将使用 TSK-GEL 色谱柱对食品成分、食品添加剂等物质的分析数据进行的汇总。 1 水溶性维生素的分离(1) 该数据为反相色谱法分析分离水溶性维生素类物质的例子。对于维生素C、烟酰胺、烟酸等高极性物质也具有良好的分离效果。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um Inj. volume ： 5 uL 2 脂溶性维生素的分离 该数据为反相色谱法分析分离脂溶性维生素类物质的例子。在仅仅使用乙腈作为流动动的条件下，并得到了分离效果良好的谱图。在同样的条件下，也可以进行维生素D2、D3的分离分析。 (4.6 mml.D.×15 cm)Eluent ： CH3CN Flow rate： 1.0mL/min Detection ： UV (280 nm) Temp. ：40°C Samples 1 ： menadione (vitamin K3) 0.5 g/L 2 ： retinol (vitamin A) 1.0 g/L 3 ： menaquinone (vitamin K2) 0.5 g/L 4：8-tocopherol (vitamin E) 1.0 g/L 5 ： o-tocopherol (vitamin E) 1.0 g/L 6： a-tocopherol acetate 2.0 g/L 7： phylloquinone (vitamin K1) 0.5 g/L 8： ergocalciferol (vitamin D2) 0.25 g/L 9： cholecalciferol (vitamin D3)0.25 g/L Inj. volume ： 5 uL 13 水溶性和脂溶性维生素的同时分离 下面的谱图为使用 TSKgel ODS-100V 5pm 色谱柱和 TSKgel ODS-100Z 5pm 色谱柱同时分离多种维生素的实例。使用 TSKgel ODS-100Z 5pm 色谱柱可以实现对高疏水性物质的精密分离。 Temp. ：25°C Samples 1： L-ascorbic acid (vitamin C))1.0 g/L 7 ： riboflavin (vitamin B2) 0.1 g/L2： nicotinic acid 1.0 g/L 8 ： retinol (vitamin A) 2.0 g/L3： thiamine (vitamin B) 0.25 g/L 9： 8-tocopherol (vitamin E) 2.0 g/L4： pyridoxal (vitamin Be) 0.1 g/L 10 ： a-tocopherol (vitamin E) 2.0 g/L5： pyridoxine (vitamin Bg) 0.1 g/L 11 ： a-tocopherol acetate 2.0 g/L6： caffeine 0.25 g/L Inj. volume ： 5 pL 4 软饮料中水溶性维生素的分离 该数据为对市售软饮料中的水溶性维生素的分析实例。测定样品经离子交换水稀释、过滤后直接上样。在同样的分析条件下，除了水溶性维生素类物质外，还可以同时实现对咖啡因的分离分析。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um (4.6 mml.D.×15 cm) Eluent ： A； 10 mmol/L HCOONH4 (pH3.5) B； CH3CNGradientt：：00 min 0%B15 min 30%B Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (254 nm) Temp. ： 40°C Samples ： Soft drink Compounds 1： pyridoxyamine 2： L-ascorbic acid (vitamin C) 0.04 g/L 3 ： thiamine (vitamin B)4 ： nicotinic acid 0.01 g/L5： pyridoxal (vitamin Be)6 ： pyridoxine (vitamin Be) 0.003 g/L7： nicotinamide8 ： pantothenic acid 7.0 g/L9 ： folic acid10： riboflavin phosphate sodium salt11 ： cyanocobalamin (vitamin B12)0.0003 g/L 12 ： riboflavin (vitamin B2) lnj. volume ：5 uL TSK-GEL 5 水溶性维生素的分离(2) 亲水反应色谱法( HILIC) 已经被广泛应用于糖类等高极性物质的分离。亲水反应色谱与反相色谱具有不同的分离选择性(请参照并比较 p.2的数据1)。下图为使用 TSKgel Amide-80 5pm 的 HILIC 色谱柱分离水溶性维生素的实例。 Column ： TSKgel Amide-80 5 um (4.6 mml.D.×25 cm)Eluent ：20 mmol/L KH2PO4(pH2.0)/CH3CN=20/80 Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (260 nm) Temp. ：40°C Samples 1 ： nicotinic acid 0.25 g/L 3： iso-ascorbic acid 1.0 g/L (erythorbic acid) 4 ： L-ascorbic acid (vitamin C) 4 ： L-ascorbic acid (vitamin C))1.0 g/L 5 ： riboflavin (vitamin B2) 0.025 g/L 6： pyridoxal (vitamin B6) 0.05 g/L 7： pyridoxine (vitamin B6) Inj. volume ： 5 uL 0 6 核酸碱基的分离(1) TSKgel ODS-100V 5pm 色谱柱由于其填料表面的极性很高，可以使用不含有机溶剂的流动相。因此，也适用于分离分析亲水性高的核酸碱基等物质。 Column ：TSKgel ODS-100V 5 um 1 (4.6 mml.D.x15 cm) 2 Eluent ： 20 mmol/L KH2PO4 (pH4.0) Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (260 nm) Temp. ：25C Samples 1： cytosine 2 ： uracil 3 3 ： guanine 5 4 ： adenine 5 ： thymine Concentration ： 0.1 g/L each Inj. volume ：5 uL 5 10 15 min 7 核酸碱基的分离(2) 以下数据为 TSKgel Amide-80 5pm 色谱柱分离核酸碱基的例子。与反相色谱柱(TSKgel ODS-100V 5pm，参照 p.4的数据6)相比，样品各组分整体保留增强、分离选择性也有所不同。 Column ： TSKgel Amide-80 5 um (4.6 mml.D.x25 cmEluent ：20 mmol/L HCOONH4(pH4.0)/CH3CN=10/90 Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV(260 nm) Temp. ： 25C Samples 1 ： thymine 2 ： uracil 3 ： adenine 4 ： hypoxanthine 5 ： xanthine 6 ： cytosine 7 ： guanine Concentration ： 0.04 g/L each Inj. volume ：5uL 10 20 8 核苷的分离 以下数据为 TSKgel ODS-100V 5pm 色谱柱分离核苷及脱氧核苷的实例。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um (4.6 mml.D.x 15cm)Eluent ： 20 mmol/L KH2PO4(pH4.0)/CH3OH=90/10Flow rate： 1.0 mL/min Detection ： UV (260 nm) Temp. ： 25C Samples 1： cytidine 2：2'-deoxycytidine 3 ： uridine 4 ： inosine 5 ： guanosine 6：2'-deoxyinosine 7 ： 2'-deoxyguanosine 8 ： thymidine 9：adenosine 10 ：2'-deoxyadenosine 0 5 10 15 min Concentration ： 0.05 g/L each Inj. volume ：5 uL 下图为 TSKgel ODS-100V 5pm 色谱柱分离核苷酸的实例。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um (4.6 mml.D.x25 cm) Eluent ：100 mmol/L KH2PO4 (pH4.5) Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (260 nm) Temp. ： 25°C Samples 1： UTP 2：UDP 3：CMP 4： GDP 5： UMP 6：ATP 7：TDP 8：ADP 9 ： IMP 10：TMP 11：AMP 12 ： dAMP Concentration ： 0.04 g/L each Inj. volume ：5uL 10 核苷酸的分离(2) 以下数据为 TSKgel Amide-80 5pm 色谱柱分离核苷酸的实例。与反相色谱柱(TSKgel ODS-100V 5um，参照 p.6的数据9)相比，几乎对所有的核苷酸保留增强、分离选择性也更好。 Column ： TSKgel Amide-80 5 um(4.6 mml.D.x25cm Eluent ： 75 mmol/L KH2PO4(pH4.5)/CH3CN=30/70 Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (260 nm) Temp. ：25°C Samples 1：TMP 11：IDP 2： dAMP 12：GDP 3：AMP 13： ATP 4：UMP 14 ： UTP 5： IMP 15 ：ITP 6：TDP 16 ： GTP 7：GMP 8：CMP 9：ADP 10： UDP Concentration ： 0.02 g/L eachInj. volume ：5 uL 下图为向流动相中添加胺类，使用反相离子对色谱分析分离核苷酸的实例。根据所添加的胺类的浓度和结构、烷烃链长度、流动相的 pH值、以及色谱柱温度的不同，测定物质的保留时间、分离选择性等也会有很大的变化。 1 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um (4.6 mml.D.x25 cm) Eluent ：A；20 mmol/L t-butylamine + H3PO4(pH6.8) B； A/CH3OH= 90/10 Gradientt：：0 min 0% B 35 min 100%B Flow rate： 1.0 mL/min Detection ： UV (260 nm) Temp. ：25°C Samples 1：CMP 8 ： CTP 15：TDP 2： UMP 9：TMP 16 ： GTP 3：CDP 10： GDP 17 ：ITP 4： dUMP 11：IDP 18：ADP 5：GMP 12 ： AMP 19 ： TTP 6 ： IMP 13：UTP 20 ： dAMP 7：UDP 14： dGMP 21 ： ATP Concentration ： 0.3 g/L each Inj. volume ：2 uL 12有机酸的分离(1) 下图是使用磷酸溶液为流动相分离有机酸的实例。从草酸、甲酸、抗坏血酸等水溶性有机酸到丙酸、衣康酸等疏水性较强的有机酸都可以获得良好的分离效果。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um (4.6 mml.D.x25 cm) Eluent ： 0.1%H3PO4 Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (210 nm) Temp. ： 40°℃ Samples min 1： oxalic acid 0.1 g/L 2 ： L-tartanic acid 0.5 g/L19.0 g/L 3： formic acid 4 ： L-malic acid 1.0 g/L 5： L-ascorbic acid 0.1 g/L 6： lactic acid 1.0 g/L 7 ： acetic acid 1.0 g/L 8： maleic acid 0.01 g/L 9： citric acid 1.0 g/L 10 ： succinic acid 1.0 g/L 11 ： fumaric acid 0.025 g/L 12 ： acrylic acid 0.1 g/L 13 ： propionic acid 2.0 g/L 14： glutaric acid 1.0 g/L 15 ： itaconic acid 0.025 g/L Inj. volume ：10 pL 以下数据为添加了10%乙腈的流动相分离有机酸的实例。与 p.7 中的数据12相比，，能够更好地分离出疏水性更强的有机酸。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um 14儿茶酚类物质的分离 茶叶中含有的大量儿茶酚类物质，是一种多酚，在体内起到抗氧化剂的作用而受到重视。使用 TSKgelODS-100Z 5um 色谱柱可以很好地分离出6种儿茶酚类物质和咖啡因。 5 10 min Inj. volume ： 5 uL 15绿茶中儿茶酚类物质的分离 以下数据为分析绿茶中儿茶酚类物质的例子。样品为茶叶经热水水提后、稀释并过滤所得。 4 Green tea A5312 6 7n 40 5 10 min4Green tea B315 62 7A0 5 10 min Compounds green tea A green tea B 1：(-)-epigallocatechin 12.8mg/L 439.5 mg/L 2 ：(-)-catechin 6.5mg/L 23.6 mg/L 3：(-)-epigallocatechin gallate 12.4 mg/L 336.9 mg/L 222.3 mg/L 2087.3 mg/L 5： (+)-epicatechin 3.1mg/L 102.2 mg/L 6： (-)-epicatechin gallate 22mq/ 49.2 mg/L 16咖啡中的甜味剂(三氯蔗糖)的分离 三氯蔗糖是一种白色粉末，具有氯原子取代蔗糖三羟基的结构。三氯蔗糖是零热量的甜味剂，甜度为蔗糖的600倍。由于其具有与砂糖相似的甜味及热稳定性，1999年在日本被指定为食品添加剂，并应用于于料和糖果等生产中。下列数据为依照日本卫生试验法·食品添加剂试验法对三氯蔗糖进行分析的实例。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um(4.6 mml.D.x25 cm)Eluent ： H2O/CH3CN=85/15Flow rate ： 1.0 mL/minDetection： RI Temp. ： 40°C Samples ： coffee(sucralose 200 ug/g added) 0 5 10 15 min Compound ： sucralose Concentration ： standard 1g/L sample 740 mg/LInj. volume ： 50 pL *：样品前处理方法请参照p.16。 TSK-GEL 苹果汁中的甜味剂(环己基氨基磺酸：甜蜜素)的分离 环己基氨基磺酸又称为甜蜜素，在日本从1956年开始被作为甜味剂使用。但是其致癌性在美国招到质疑后，1969年开始被禁止使用。由于在中国和欧洲诸国到现在为止还没有被禁止使用，因此有时仍会在相关商品中检测到。下列数据是依据日本卫生试验法·食品添加剂试验法对环己基氨基磺酸进行分析的实例。 18DL-a-硫辛酸的分离(1) DL-a-硫辛酸具有烷烃链(末端为羧酸)结合在含两个硫原子的五元环的结构。由于其抗氧化能力强，且有促进糖代谢的功能，因此被认为对减肥有效。下列数据为使用反相色谱法对α-硫辛酸进行分离的例子。下面的谱图为放大后的分析结果。 Column： TSKgel ODS-100Z 5 um (4.6 mml.D.x25 cm)Eluent ：5 mmol/L NaH2PO4 (pH3.0)/CH3CN/CH3OH=920/180/1160 Flow rate： 1.2mL/min Detection ： UV (215 nm) Temp. ： 35°C 0 5 10 min Sample ： DL-a-lipoic acid (thioctic acid) Concentration ： 1 g/L Inj. volume ： 20 pL Column ： TSKgel G1000HxL 20饮料中辅酶Q10的分离 辅酶Q10具有辅助机体产生能量的作用，也可称为维生素Q、泛醌等，作为食品增补剂受到广泛重视。辅酶Q10为脂溶性物质，在反相色谱分析中保留时间很长，因此可以使用添加有 THF 的流动相进行测定。在这样的分析条件下，还可以同时分析辅酶Q9和生育酚(维生素E)等物质。 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um(4.6mml.D.×15 cm)Eluent ： THF/CH3CN=20/80Flow rate ： 1.0 mL/minDetection： UV(270 nm)Temp. ： 40C 10 min 21 葡萄糖酸氯己定的分离 葡萄糖酸氯己定是一种抗菌范围广、抗菌性强、并具有卓越的持久性杀菌作用的抗菌剂。广泛应用于化妆水、漱口剂等产品中。在日本卫生试验法·化妆品试验法的记载中介绍了流动相里添加 SDS(阴离子性表面活性剂)进行葡萄糖酸氯己定的分析方法，但是下列数据位不添加 SDS、在酸性条件下进行葡萄糖酸氯己定分离的实例。 22糖果中食用色素的分离 着色剂大致可以分为合成色素和天然色素两两。合成色素的大多数是焦油色素，并有3000种以上，但是很少作为食用着色剂使用。1960年的时候，有24种焦油色素在日本被批准使用。但是由于存在潜在致癌性等原因，目前只有12种焦油色素被允许使用。以下数据是对从某种糖果中提取到的色素进行分析的实例。通过改变检测波长可以对不同颜色的色素进行高选择性的检测 Column ： TSKgel ODS-100V 5 um 0 2 4 6 8 10 12 min (4.6 mml.D.x15 cm) Eluent ： A； 10 mmol/L CH3COONH4 B； CH3CNGradientt：：0 min 56%20 min 70 9%BFlow rate ： 1.0 mL/min Detection： UV (254/630 nm) Temp. ：40°C Samples 1： Food Yellow No.4 10 g/L 2 ： Food Red No.2 25 g/L 3： Food Blue No.2 20 g/L 4： Food Red No.102 25 g/L 5： Food Yellow No.5 25 g/L 6： Food Red No.40 25 g/L 7： Food Green No.3 100 g/L 8： Food Blue No.1 100 g/L 9： Food Red No.3 25 g/L 10： Food Red No.104 25 g/L 11 ： Food Red No.106 20 g/L 12 ： Food Red No.105 50 g/L Inj.volume ：5pL 绿原酸(3-咖啡酰奎宁酸)具有与儿茶素、类黄酮等相似的抗氧化作用。咖啡豆中大量含有该物质。 Column ： TSKgel ODS-100Z 5 um 24咖啡中绿原酸的分离 咖啡豆热水抽提稀释后，可直接进行测定。通过紫外可视光检测器选择适当的波长，可以选择性地、高灵敏度地分离分析绿原酸和咖啡酸。 Column ： TSKgel ODS-100Z 5 um (4.6 mml.D.x15 cm) Eluent ：10 mmol/L HCOONH4 (pH3.5) /CH3CN=90/10 Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (270/325nm) Temp. ：40°C Samples ： coffee 8 g Compound：： 1；chlorogenic acid 0.06 g/L2 ； caffeine 0.09 g/L Inj. volume ： 5 uL *样品前处理 样品，8g加100mL热水煮沸10分钟用流动相稀释10倍 HPLC分析 25大豆提取液中异黄酮类的分离 大豆中含有大量的异黄酮，其具有类似雌性激素的作用。大豆异黄酮预防更年期障碍及衰老等的效果受到广泛关注。下图为分析大豆乙醇抽提液的实例。 *： 样品前处理(参见图表中所示) 26大豆饮料中异黄酮类物质的分离 下图为大豆健康饮料中异黄酮类物质的分析实例。 27大豆多肽果冻饮料提取液的分离 大豆多肽是大豆蛋白酶解后产生的物质，具有不同的结构和分子量分布。以下数据数利用 SEC 对大豆多肽果冻饮料提取液分析的实例。 Column ： TSKgel G2000SWxL×3 (7.8mml.D.x30 cm×3) Eluent ：0.1%TFA+45% CH3CN Flow rate ： 1.0 mL/min Detection ： UV (215nm) Temp. ： 30 °C Sample ： soy peptide beverageCompound ： soy peptide Inj. volume ： 50 pL *：样品前处理(参见图表中所示) 1 三氯蔗糖(数据16)一依照日本食品添加剂试验法 前处理操作： 1)将样品20g与透析内液20mL 混合后装入透析膜 2) 将透析膜吊在 200mL的量筒内，加入透析外液使全部液体量达到200mL 3)用搅拌器搅拌，在室温下静置24小时 4)取透析外液 40mL， 并加载到固相萃取柱上 5) 固相萃取柱用10mL 水、0.2 mol/L NaOH 5mL、水 10mL淋洗 6)用5mL甲醇洗脱， 且用氮气干燥后，用1mL水溶解 7)溶解液用过滤膜(孔径0.45um)过滤后，测定 透析内液：0.01 mol/L HCI+ 100 g/L NaCl 透析外液：0.01mol/L HCI 固相萃取柱： OnGuard-RP (Dionex)3 根串联 透析膜：人造肠衣管直径23.8mm 2 环己基氨基磺酸(数据17)一依照日本食品添加剂试验法 前处理操作： 1)将样品20g与透析辅助液20mL 混合后装入透析膜 2)将透析膜吊在 200mL的量筒内，加入透析辅助液使全部液体量达到200mL 3)用搅拌器搅拌，在室温下静置48小时 4)取25mL透析外液，加入 0.1 mol/L TBA 溶液 5mL、0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)20mL 混合后作为样品溶液 5)加载到固相萃取柱上，用30mL水淋洗 6)使用乙腈/水(70/30)溶液10mL洗脱，并用分液漏斗收集 7)分液漏斗中加入50%的H2SO42mL、5mL己烷、1mLNaClO4后，振荡1分钟 8)除去水相后，己烷相中加入5% 的NaHCO325 mL后振荡 9)除去水相后，用HPLC测定己烷相 透析辅助液：0.02 mol/L NaOH 固相萃取柱： Bond Elute Jr. C18 (Varian)4根串联 透析膜：人造肠衣管，直径23.8mm 样品名 .页码 数据号 样品名 页码 数据号 UTP 6 9， 10 7 11 X xanthine........ ...... 5 5 7 uridine 5 8 TOSOH CORPORATIONBIOSCIENCE DIVISION Address： Shiba-Koen First Bldg. 3-8-2Shiba， Minato-Ku， Tokyo 105-8623， Japan TEL： +81-3-5427-5180FAX： +81-3-5427-5220 E-mail： hlc@tosoh.co.jp Website： www.separations.asia.tosohbioscience.com HLC database： www2.tosoh.co.jp/hlc/hlcdb.nsf/StartE?OpenForm TOSOH BIOSCIENCE LLC Address： 3604 Horizon Drive， Suite 100 King of Prussia， PA 19406， USA TEL： +1-484-805-1219 FAX：+1-610-272-3028 E-mail： info.tbl@tosoh.com Website： www.tosohbioscience.com TOSOH 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