蛋白质中聚集体的直接可视化、尺寸测量和计数检测方案(其它光学测量)

应用指南 蛋白质中聚集体的直接可视化、尺寸测量和计数 简介 检定的蛋白质聚集状态对了解生物医药产品的稳定性和功效是至关重要的。当有蛋白质聚集体时，对产品的质量的生物活性和原免疫性两方面有很大的影响。 很多聚集体遇到生物样品会按照大小和特性排列(如：可溶的和不可溶的，共价的和非共价的或者可逆的和不可逆的)。蛋白质聚集体的范围跨度很大，从小型的低聚体(纳米级)到包含成百万的单体单元构成的不可溶的微米级的聚集体。 在制造过程(细胞培养、提纯、形成)、贮存、分配和产品处理过程中的任何一步都可能产生蛋白质聚集体。它可能是由于各种压力引起的，比如，搅拌、暴露在极端的pH下、温度、离子强度或者各种界面(如，气-液界面)。高蛋白含量(像单克隆抗体形成的情况)情况下，会出现进一步增加聚集体的可能性。 因此，在开发、制造以及药物的后续贮存和描述产物时都必须仔细描述和控制聚集体。同样地，可以通过监测聚集体的状态，修改或者优化生产过程来实现。 现在NanoSight提供一种以激光为基础的纳米粒子跟踪分析 (NTA)的新系统，它可以使纳米粒子(如蛋白质聚集物)直接在液相中实时地观测到单个的颗粒并且对其计数。 该技术具有快速、可靠、准确并且成本低，正因为这些特点使之成为现存纳米颗粒分析方法(如DLS(又称电子相关光谱 PCS，)或者电子显微镜(EM))的很好的替代或者补足。 蛋白聚集体成像 NanoSight仪器是唯一可以在30nm-1000nm范围内观察到蛋白聚集体的。 可以肉眼观察到样品中聚集物质的存在(图1)，用户可以快速生成颗粒大小分布轮廓图以及计数可见聚集物(聚集数量浓度)(图2)。 图1.典型的用 NanoSight 技术生成的图像。这图像可以让用户立即识别样品中特有的特征及聚集物。 图2.颗粒大小分布(数量分布)样品同图1 颗粒大小的覆盖范围 过去大量的技术用来描述蛋白质和蛋白聚集物。分离技术常常用来区别蛋白质和蛋白聚集物，再进一步分析分离样品。 分析技术： 动态光散射 (DLS) 多角度激光光散射(MALLS) 紫外光谱 光透法 微血管成像技术(MFI) 纳米微粒跟踪分析 (NTA)分离技术： 尺寸排阻色谱法 (SEC) 场流分级法 (FFF) 毛细管电泳法 (CE) 分析超速离心法 (AUC) 范围小于30mm 我们常见SEC与D L S、MALLS或者UV光谱匹配。尺寸排阻色谱法可以从聚集物中分离出蛋白单体。我们以DLS为例，在随后的分析中我们可以精确地测量提纯部分的大小以及分子质量。由于受上述SEC排阻限制没有分离的过程，因此不适合如DLS的提及及析系统。MALLS分析可以帮助减少在未分离的样品中较大聚集物的影响，但需要技术说明。 范围30-1000nm NanoSight技术可以对大小在30-1000nm之间的蛋白聚集物单独成像，并且可以根据追踪单个微粒的布朗运动来测定微粒的大小。颗粒单独分析可以生成高分辨率的颗粒数分布。 在这个范围很少用ＤLS，因为高浓度的蛋白单体和那些少量的大而清晰的聚集物对信号影响很大。 尽管分馏法(如FFF)有助于ＤLS分析，但是由于潜在的聚集物使得ＦFF在稀释过程中效果不好。此外，这些“中型”聚集物稀释后的浓度常常会低于DLS的浓度灵敏度。在使用NanoSight技术时无需稀释，在30-1000mm之间蛋白聚集体正是该技术的最佳浓度。 NanoSight 技术(蛋白聚集体大约30nm)很好的弥补了上述SEC/DLS 或者 SEC/UV中SEC的排阻限制。NanoSight 技术使得传统的单颗粒成像/模糊技术变得可行。若事先没有对聚集体样品进行分离，IDLS将生成双峰图，如图2所示。 主峰是由大量的单体颗粒形成的，而第二个高峰是由很大的聚集体发出大量光强。尽管对信号起主要影响作用的主要单体颗粒和少量的大聚集体存在，但是不合适的ＤLS分析系统会显示在这些点之间不存在颗粒物。 当颗粒大小低于该技术的检出限时， NanoSight技术将无法测量主要单体的大小。当颗粒物大于30nm时，该技术可以对蛋白聚集体进行单独颗粒分析，并形成唯一的蛋白聚集体的高分辨率颗粒数分布。 图3.典型的颗粒大小分布图(样品中可能含有蛋白聚集体) 实例1-剪切应力 NTA at 45nm diameter (Figure 4a).下面例子中，通过NAT直径为45nm时可以正确测得病毒(图4a)。然而同一样品通过几秒钟的震荡，剪切应力诱发了病毒样品中颗粒物的聚集。 Particle Size Particle Size 图4.病毒样品颗粒大小轮廓分布 a)之前和 b) 之后产生剪切应力诱发聚集。注意在颗粒物聚集时，标准纵坐标的浓度下降(浓度范围大约80×106颗粒/ml-50×106颗粒/ml)。其他光散射技术(如DLS)不能获得这些信息。 来自： Moser M.， (2008) Emerginganalytical techniques to characterizevaccines， Proc. Intl. Conf. Vaccines Europe， Brussels， December 2008. 实例2一热应力 在这实例中，样品免疫球蛋白在NanoSight的样品室里在50℃下加热35分钟，接着聚集体采用NTA程序进行分批捕获。图5中显示的是与NTA视频图像(左面板)一致的大小分布图(中间面板)和三维图(大小/强度/浓度；右面板)。 t-0 min 600 Size (nm) 图5.在50℃时热应力诱导IgG蛋白聚集的时间进程 数据来自： Filipe， Hawe and Jiskoot (2010)“Critical Evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)by NanoSight for the Measurement of Nanoparticles and Protein Aggregates”， Pharmaceutical Research， DOI：10.1007/s11095-010-0073-2 应用指南 实例3-在不同水质中稀释后的聚集体 在这个实例中，将两种类型的纳米颗粒(壳聚糖纳米粒子和校准金纳米粒子)用不同的水质稀释。 1. 自来水(来自硬水区) 2. 去离子水(电池中使用的) 3. 高纯水，试剂级水 (18MQ) A)壳聚糖纳米粒子 首先，壳聚糖纳米粒子样品(黏附多糖)的开发是用于药物传递(由IPATIMUP，，一家葡萄牙的致力于健康科学研究的非盈利机构提供)，在上述的三种水样中稀释，颗粒大小在两个时间段测：稀释后立即测和稀释后5-10分钟测. 图7：颗粒大小轨迹对比(由NanoSight 生成的稀释于不同水质中30nmNIST金纳米颗粒60秒轨迹录像) 在下面图6中，我们可以清楚地看到水中离子和矿物质含量减少对聚集体的影响。左面板显示的是在自来水的样品中出现了大量的聚集体(红线t-0，白线t=5-10分钟)，中间面板显示在去离子水的样品中聚集体减少了，右面板显示在超纯水(没有离子)样品中没有出现聚集 联系方式 要想了解更多信息，请联系NanoSight公司或者当地的经销商，请登入www.nanosight.com 体)金纳米颗粒(NIST标准) 将校准的30nm金颗粒(NIST)稀释到与上述相同的三种类型的水中：自来水，去离子水和18MQ的超纯水(只有纳米颗粒)， 然后用NanoSight系统分析浓度相同的样品。图7所示，聚集程度与水质纯度有关，上述三个样品中只有18MQ的超纯水没有聚集体。 Analysis in g first minute Analysis after 5-10 minutes 图6.对比在不同水质不同时间壳聚糖聚合的过程 (t=0和t=5-10分钟) MNanosight Ltd， Minton Park， London Road， Amesbury， Wiltshire，SP RT， UK第页T：(+() F：(+ () E： enquines@nanosight.co.ukwww.nanosight.com