病毒株，重组疫苗，结合疫苗，病毒样颗粒蛋白中疫苗的等电点，电荷异质性检测方案(其它医药/卫生/临床专用仪器/仪表)

Maurice iCIEF 法用于疫苗质量控制 疫苗根据工艺分为减毒疫苗，灭活疫苗，亚单位疫苗，基因工程疫苗，涉及及系方法进行质量控制，其中等电点及电荷变异体对于鉴别和工艺稳定性至关重要。本文涉及病毒，重组疫苗， mRNA 疫苗，病毒样颗粒(VLP)等不同类别疫苗的等电点及电荷异质性检测。 新型人乳头瘤病毒(HPV)治疗性疫苗等电点测定 上海泽润生物技术有限公司质量研究部，利用 iCIEF， 对新型人乳头瘤病毒(HPV)治疗性疫苗 HPV16E7-HBcAg-Hsp65 融合蛋白的等电点，进行图谱鉴定。 Characterization and evaluation of the immune responses elicited by a novel humanpaplllomavirus (HPV) therapeutic vaccine： HPV16E7-HBcAg-Hsp65 fusion protein，]VirolMethods， 197， 1-6 Mar 2014. 活体脊髓灰质炎病毒等电点检测 Isoelectric point(pl) 荷兰转化疫苗研究所利用 iCIEF，观察不同批次，以及不同储存形式的1型 PV(polio vaccine)Mahoney 菌株培养的活体脊髓灰质炎病毒等电点的分析。从而判断不同批次间病毒的 pl测定的可重复性以及冻存对病毒 pl 值的影响。结果显示，利用 iCIEF 观察到，不同批次 A-D 之间的 pl 峰型是可比较的。且新鲜样品A 与存储在-80℃的批次 B-D， 在对病毒 pl峰型上没有影响。 Isoelectric point (pl) 利用iCIEF， 观察不同菌株培养的脊髓灰质炎病毒 pl 峰型图。为后续工艺开发，建立不同脊髓灰质炎病毒种类的 pl 表征图。 Isoelectric point determination of live polioviruses by caplllary isoelectric focusing with wholecolumn imaging detection， Anal Chem， 85 (12)， 6089-94 2013 Jun 18. 诺如病毒病毒样颗粒等电点分析 Isoelectric point (pl) 加拿大圭尔夫大学食食安全研究所利用 iCIEF，观察6个不同种类的诺如病毒病毒样颗粒(norovirus virus-like particles， VLPs) 的 pl峰型图。可以观察到每个 VLP都有一个主峰(用于确定 pl) 和几个小峰。后续研究发现，不同颗粒大小的VLP可以呈现不同的 pl 值。由于 颗粒的不稳定，可以降解形成不同分子量的切割产物，因此构成峰形图中的小峰。 Isoelectric point (pl) 利用 iCIEF 观察诺如病毒病毒样颗粒的 pl峰重现性。结果显示，利用 iCIEF 检测到诺如病毒病毒样颗粒的 pl峰重现性很好。 Isoelectric Point Determination of Norovirus Virus-Like Particles by Caplllary IsoelectricFocusing With Whole Column Imaging Detection， Anal Chem， 76 (1)， 48-52 2004 Jan 1. 脂质纳米颗粒疫苗表面电荷表征 脂质纳米颗粒(LNP)除了用于小分子， siRNA， mRNA 和 pDNA的药物递送，还被用于治疗和疫苗的研发。 Merck疫苗分析和开发部门第一次基于成像毛细管等电聚焦(iCIEF)表征 LNPS 包装的 mRNA的疫苗。他们利用 iCIEF， 通过对两性电解质以及甘油的添加来优化检测 LNP 的表观 pl。确定好优化条件后，对不同 LNP 样品的三种独立制剂之间的 pl 进行重复性检测，结果显示三次样品的峰形保持一致，重现性很好。通过测试了五种浓度的 mRNA 的 LNP样品的pl， 使 用线性回归分析，将标准品 (LNP)的峰面积对mRNA浓度(ug/mL)作图。结果显示，该线性范围的测定系数(R)为0.997， 显示出很强的线性度，证明了该技术进行定量分析的能力。 配制不同的 LNP 批次，每个批次包含不同的阳离子脂质与 mRNA的比率(摩尔/摩尔)。利用iCIEF对所有制备的 LNP的进行表观 pl检测，然后将 pl 值与阳离子脂质和 mRNA 浓度作对数图。结果显示， LNP 表观 pl与阳离子脂质浓度有很强的相关性，R2=0.956， 但与 mRNA浓度相关性很弱， R2=0.653。揭示了阳离子脂质位于 LNP 表面， 而 mRNA 位于 LNP 内部。且 LNP充当保护 mRNA 的保护性疏水屏障。 利用 iCIEF 检测有无装载 mRNA 的 LNP 的表观pl。结果显示，带有和不带有 mRNA 的 LNP在大约7.7处具有相似的 pl。但旦含 mRNA 的 LNP的峰面积大于不包含 mRNA 的 LNP的峰面积。这可能是散射光和 mRNA 吸光度组合的原因。 为了证明 LNP的表观 pl取决于 LNP 表面的阳离子脂质，用 iCIEF 检测两种不同 pKa 的阳离子脂质的 LNP的pl。结果显示， LNP的 pl分离是基于阳离子脂质 pKa 值。用 iCIEF 方法可用于鉴定 LNP样品中的阳离子脂质。 用 iCIEF 方法可以检测热应激时 LNP 的稳定性。结果显示，随着温度的升高，未装载 mRNA(图B)的LNP出现轻微的酸移和尖峰，意味着空的 LNP 随着温度的升高产生不稳定或者发生聚集。装载 mRNA的LNP(图A)随着温度的升高，“酸性变异体"与主峰基线分离得越大。这可能是由于温度的升高， mRNA 暴露在 LNP 表面而造成的。 Development of an imaged caplllary isoelectric focusing method for characterizing thesurface charge of mRNA lipld nanoparticle vaccines， Electrophoresis，40(18-19)，2602-2609Sep 2019. 重组乙肝疫苗制剂稳定性研究 Buffer A Buffer B BufferC Merck 疫苗研发中心，利用 iCIEF 考察重组乙肝疫苗，在3种不同制剂缓冲液及不同冻融次数情况下，等电点变异以及图谱稳定性。从而判断疫苗制剂缓冲液的稳定性。结果显示，利用 iCIEF 观察到，从制剂缓冲液A到C这三种制剂中的pl 值2.7均没有变化。但在1x~5x冻融循环后，在制剂缓冲液B和C中观察到了 spikes 峰，但在制剂缓冲液A的峰型仍然很稳定。因此，与配方缓冲液B或C相比，配方缓冲液A为 HBsAg 提供了最稳定的缓冲体系。 Development of Imaged Caplllary Isoelectric Focusing (iCIEF) method and Use of CaplllaryZone Electrophoresis (CZE) in Hepatitis B Vaccine (RECOMBIVAX HBQ). Electrophoresis， 35(7)， 1072-8 Apr 2014. 结合疫苗载体蛋白的验证、工艺评价、稳定性研究 pl 对 CRM197 蛋白的验证除了可以通过将 pl 值和电泳图谱与参考标准谱图相匹配，此外，可以通过结合靶向 CRM197的 mAb 来阐明该 CRM197 蛋白的特异性。 Merck 疫苗分析开发研究实验室，利用 iCIEF观察，在用其特异性抗 CRM197 mAb 滴定CRM197时， I电泳图谱发生的变化。结果显示，电泳图谱以约1：1的摩尔比时停止变化。另外，此 CRM197 的酸性峰也与其主峰一起移动，表明这些酸性形式在与其抗 CRM197 mAb结合方面也具有活性。 pl 利用 iCIEF 评价 CRM197 的上游和下游工艺。结果显示，上游样品 S1 和 S2的浓度测量结果的 RSD <15%，样品 S3 和 S4 的 RSD <5%。体现了 iCIEF 方法的高分辨率，以及可以用于快速筛选最高的细胞克隆生产者和最佳的发酵条件，以提供最大的 CRM197 效价。 pl 利用 iCIEF 监视贮存过程中蛋白的电荷异质性，作为产品稳定性评估的一部分。结果显示，在3个月的存储期间(22℃)， CRM197 的酸性峰(pl5.77和5.82)增加，而主峰(pl5.9)降低。 利用 iCIEF 观察 CRM197 在四个不同温度下三个月的稳定性曲线。在22℃(红线)下，酸性峰面积增加，主峰面积减少；在4℃(蓝线)下，酸性峰面积增加慢得多，表明在此温度下三个月内略有降解。在-20℃(绿线，)和-70℃(黑线)的酸性峰没有变化，表明此 CRM197在这两个温度下非常稳定。 Use of imaged caplllary isoelectric focusing technique in development of diphtheria toxinmutant CRM197， Electrophoresis， 35 (7)， 1065-71Apr 2014. Merck 生物制剂和疫苗研究实验室，利用 iCIEF 的 280nm紫外和收和荧光模式，检测不同发酵条件下，疫苗常用常体蛋白 CRM197 的 pl差异。结果显示，在吸收光模式下， S1 和 S4没有从其它杂质中分离出来。但是在荧光模式下，所有四个样品中均清楚地观察到 CRM197， 体现了 iCIEF 荧光模式下更高的灵敏度和选择性。 Quantitation of CRM197 using imaged caplllary isoelectric focusing with fluorescencedetection and caplllary Western， Anal Biochem， 534， 19-23 2017 Oct 1. 疫苗根据工艺分为减毒疫苗，灭活疫苗，亚单位疫苗，基因工程疫苗，涉及一系方法进行质量控制，其中等电点及电荷变异体对于鉴别和工艺稳定性至关重要。本文涉及病毒，重组疫苗，mRNA疫苗，病毒样颗粒（VLP)等不同类别疫苗的等电点及电荷异质性检测。1.新型人乳头瘤病毒（HPV）治疗性疫苗等电点测定上海泽润生物技术有限公司质量研究部，利用iCIEF，对新型人乳头瘤病毒（HPV）治疗性疫苗HPV16E7-HBcAg-Hsp65融合蛋白的等电点，进行图谱鉴定。Characterization and evaluation of the immune responses elicited by a novel human papIllomavirus (HPV) therapeutic vaccine: HPV16E7-HBcAg-Hsp65 fusion protein, J Virol Methods, 197, 1-6 Mar 2014.2.活体脊髓灰质炎病毒等电点检测荷兰转化疫苗研究所利用iCIEF，观察不同批次，以及不同储存形式的1型PV（polio vaccine） Mahoney菌株培养的活体脊髓灰质炎病毒等电点的分析。从而判断不同批次间病毒的pI测定的可重复性以及冻存对病毒pI值的影响。结果显示，利用iCIEF观察到，不同批次A-D之间的pI峰型是可比较的。且新鲜样品A与存储在-80°C的批次B-D，在对病毒pI峰型上没有影响。利用iCIEF，观察不同菌株培养的脊髓灰质炎病毒pI峰型图。为后续工艺开发，建立不同脊髓灰质炎病毒种类的pI表征图。Isoelectric point determination of live polioviruses by capIllary isoelectric focusing with whole column imaging detection,Anal Chem, 85 (12), 6089-94 2013 Jun 18.3. 诺如病毒病毒样颗粒等电点分析加拿大圭尔夫大学食品安全研究所利用iCIEF，观察6个不同种类的诺如病毒病毒样颗粒（norovirus virus-like particles, VLPs）的pI峰型图。可以观察到每个VLP都有一个主峰（用于确定pI）和几个小峰。后续研究发现，不同颗粒大小的VLP可以呈现不同的pI值。由于颗粒的不稳定，可以降解形成不同分子量的切割产物，因此构成峰形图中的小峰。利用iCIEF观察诺如病毒病毒样颗粒的pI峰重现性。结果显示，利用iCIEF检测到诺如病毒病毒样颗粒的pI峰重现性很好。Isoelectric Point Determination of Norovirus Virus-Like Particles by CapIllary Isoelectric Focusing With Whole Column Imaging Detection, Anal Chem, 76 (1), 48-52 2004 Jan 1.4. 脂质纳米颗粒疫苗表面电荷表征脂质纳米颗粒（LNP）除了用于小分子，siRNA，mRNA和pDNA的药物递送，还被用于治疗和疫苗的研发。Merck疫苗分析和开发部门第一次基于成像毛细管等电聚焦（iCIEF）表征LNPS包装的mRNA的疫苗。他们利用iCIEF，通过对两性电解质以及甘油的添加来优化检测LNP的表观pI。确定好优化条件后，对不同LNP样品的三种独立制剂之间的pI进行重复性检测，结果显示三次样品的峰形保持一致，重现性很好。通过测试了五种浓度的mRNA的LNP样品的pI，使用线性回归分析，将标准品（LNP）的峰面积对mRNA浓度（μg/mL）作图。结果显示，该线性范围的测定系数（R2）为0.997，显示出很强的线性度，证明了该技术进行定量分析的能力。配制不同的LNP批次，每个批次包含不同的阳离子脂质与mRNA的比率（摩尔/摩尔）。利用iCIEF对所有制备的LNP的进行表观pI检测，然后将pI值与阳离子脂质和mRNA浓度作对数图。结果显示，LNP表观pI与阳离子脂质浓度有很强的相关性，R2 = 0.956，但与mRNA浓度相关性很弱，R2 = 0.653。揭示了阳离子脂质位于LNP表面，而mRNA位于LNP内部。且LNP充当保护mRNA的保护性疏水屏障。利用iCIEF检测有无装载mRNA的LNP的表观pI。结果显示，带有和不带有mRNA的LNP在大约7.7处具有相似的pI。但包含mRNA的LNP的峰面积大于不包含mRNA的LNP的峰面积。这可能是散射光和mRNA吸光度组合的原因。为了证明LNP的表观pI取决于LNP表面的阳离子脂质，用iCIEF检测两种不同pKa的阳离子脂质的LNP的pI。结果显示，LNP的pI分离是基于阳离子脂质pKa值。用iCIEF方法可用于鉴定LNP样品中的阳离子脂质。用iCIEF方法可以检测热应激时LNP的稳定性。结果显示，随着温度的升高，未装载mRNA（图B）的LNP出现轻微的酸移和尖峰，意味着空的LNP随着温度的升高产生不稳定或者发生聚集。装载mRNA的LNP（图A）随着温度的升高，“酸性变异体”与主峰基线分离得越大。这可能是由于温度的升高，mRNA暴露在LNP表面而造成的。Development of an imaged capIllary isoelectric focusing method for characterizing the surface charge of mRNA lipId nanoparticle vaccines, Electrophoresis, 40 (18-19), 2602-2609 Sep 2019.5.重组乙肝疫苗制剂稳定性研究Merck疫苗研发中心，利用iCIEF考察重组乙肝疫苗，在3种不同制剂缓冲液及不同冻融次数情况下，等电点变异以及图谱稳定性。从而判断疫苗制剂缓冲液的稳定性。结果显示，利用iCIEF观察到，从制剂缓冲液A到C这三种制剂中的pI值2.7均没有变化。但在1x~5x冻融循环后，在制剂缓冲液B和C中观察到了spikes峰，但在制剂缓冲液A的峰型仍然很稳定。因此，与配方缓冲液B或C相比，配方缓冲液A为HBsAg提供了最稳定的缓冲体系。Development of Imaged CapIllary Isoelectric Focusing (iCIEF) method and Use of CapIllary Zone Electrophoresis (CZE) in Hepatitis B Vaccine (RECOMBIVAX HB®). Electrophoresis, 35 (7), 1072-8 Apr 2014.6.结合疫苗载体蛋白的验证、工艺评价、稳定性研究对CRM197蛋白的验证除了可以通过将pI值和电泳图谱与参考标准谱图相匹配，此外，可以通过结合靶向CRM197的mAb来阐明该CRM197蛋白的特异性。Merck疫苗分析开发研究实验室，利用iCIEF观察，在用其特异性抗CRM197 mAb滴定CRM197时，电泳图谱发生的变化。结果显示，电泳图谱以约1：1的摩尔比时停止变化。另外，此CRM197的酸性峰也与其主峰一起移动，表明这些酸性形式在与其抗CRM197 mAb结合方面也具有活性。利用iCIEF评价CRM197的上游和下游工艺。结果显示，上游样品S1和S2的浓度测量结果的RSD<15％，样品S3和S4的RSD<5％。体现了iCIEF方法的高分辨率，以及可以用于快速筛选最高的细胞克隆生产者和最佳的发酵条件，以提供最大的CRM197效价。利用iCIEF监视贮存过程中蛋白的电荷异质性，作为产品稳定性评估的一部分。结果显示，在3个月的存储期间（22℃），CRM197的酸性峰（pI 5.77和5.82）增加，而主峰（pI 5.9）降低。利用iCIEF观察CRM197在四个不同温度下三个月的稳定性曲线。在22℃（红线）下，酸性峰面积增加，主峰面积减少；在4℃（蓝线）下，酸性峰面积增加慢得多，表明在此温度下三个月内略有降解。在-20℃（绿线，）和-70℃（黑线）的酸性峰没有变化，表明此CRM197在这两个温度下非常稳定。Use of imaged capIllary isoelectric focusing technique in development of diphtheria toxin mutant CRM197, Electrophoresis,35 (7), 1065-71 Apr 2014.Merck生物制剂和疫苗研究实验室，利用iCIEF的280nm紫外吸收和荧光模式，检测不同发酵条件下，疫苗常用载体蛋白CRM197的pI差异。结果显示，在吸收光模式下，S1和S4没有从其它杂质中分离出来。但是在荧光模式下，所有四个样品中均清楚地观察到CRM197，体现了iCIEF荧光模式下更高的灵敏度和选择性。Quantitation of CRM197 using imaged capIllary isoelectric focusing with fluorescence detection and capIllary Western, Anal Biochem, 534, 19-23 2017 Oct 1.