果汁饮料中葡萄糖测定检测方案(电化学工作站)

食品科学※分析检验2005， Vol. 26， No. 10187 基于普鲁士蓝的葡萄糖氧化酶电极用于果汁饮料中葡萄糖测定 李彤1，姚子华2，丁良 (1.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002； 3.河北职工医学院，河北保定 071000) 摘 要：利用PB修饰电极结合二氧化硅溶胶凝胶技术制备的葡萄糖氧化酶电极应用于果汁饮品中葡萄糖含量的测定研究。以牛血清白蛋白代替葡萄糖氧化酶制得的电极作对照实验，来研究样品基质对测定的影响，另外考察了可能的干扰物对酶电极的干扰情况，实验结果表明，样品基质等对测定没有明显的干扰。 测定结果重现性较好，回收率在102.1%~104.2%。 关键词： 葡萄糖测定；酶电极；普鲁士蓝；果汁 Determination of Glucose by the Novel GlucoseOxidaseElectrodeBased on Prussian Blue in JuiceBeverages LI Tong'， YAO Zi-hua²， DING Liang’ (1.College of Environment Science and Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018，China； 2.College of Chemistry and Environmental Science， Hebei University，Baoding 071002，China； 3.Hebei Medical College for Continuing Education， Baoding 071000， China) Abstract： The novel glucose oxidase electrode based on Prussian Blue(PB)-modified electrode combined with SiO sol-gelimmobilizationhas been used to determinate the glucose content in juices and beverages. In this experiment， the BSA electrodemade similarly by taking BSA instead of GOD， to be served as thereference electrode， has been employed to study the interferenceofmatrixandinterferingspecies inreal sample. Thetestingresults showed that thematrixand interferingspecies didnot produceany observable inter ference for the assay. Thereproducibility was satisfactory and the recovery was found to be in therange of102.1%~104.2%. Key words： determination of glucose； enzyme electrode prussian blue juice beverage 中图分类号：0629.11；0657.15 文献标识码A 文章编号：1002-6630(2005)10-0187-04 食品分析和食品质量控制中分析方法很多。如在对葡萄酒及其他果汁饮品的分析中，经常使用分光光度法、气相色谱、液相色谱、薄层色谱等方法对抗坏血酸[1，2]、有机酸[3]、乳酸[4]、糖类[5，6]等成分进行分析。这些方法固然有他们的优点，但是需要预处理分离、需要多种试剂、操作烦琐、仪器昂贵等使得其应用受到一定的限制。目前电化学传感器和生物传感器的研究证明，由于高选择性、高灵敏性、不用分离、直接分析而在食品分析和质量控制方面具有广阔的应用前景[7~9]. 食品中存在的糖类主要是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及海藻糖等，一般分析时不单独测定构成食品的各 种糖的含量，而是将样品水解后直接测总量[5]，这样做不能知道构成食品的各种糖的含量。近年来，为了研究食品，改善营养，常常需要知道各种糖在食品中含量，为此就有必要建立各种糖的分析方法，有针对地进行分析。果汁、葡萄酒等中的葡萄糖含量。测定方法有HPLC法[10]、薄层层析法[11]、酶联分光光度法I6]等。电化学生物传感器对食品的直接分析是有效、快速而经济的。但实际应用于真实食品样品的不多，主要的问题是电活性物质对响应信号的影响干扰底物的分析。配酶电极在对葡萄糖检测时，通常是利用酶促反应生成的 H202在铂电极上的电氧化信号来指示溶液中底物葡萄糖浓度 的，高的工作电位(>600mV)使得一些电活性物质如抗坏血酸等也被氧化形成干扰信号。消除这些干扰的一个方法是降低工作电位。研究表明， PB修饰电极在低电位下对H202有灵敏的电催化还原作用，利用PB修饰电极构成生物传感器方可减小干扰[12，13]。 作者研究的新型葡萄糖氧化酶电极正好是利用PB对H202在低电位下有灵敏的电催化还原作用[12]，可以用来检测葡萄糖的含量。本文研究的目的是利用PB修饰电极结合二氧化硅溶胶凝胶技术制备的葡萄糖氧化酶电极应用于实际食品样品的葡萄糖的检测。以果汁饮品作为样品，建立了酶电极检测的方法，进行了干扰性实验，回收率实验，结果证明该法快速，简便，不经分离，直接可用于果汁饮品中葡萄糖分析。 1 材料与方法 1.1 仪器与药品 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase from Aspergillus niger，GOD， E.C1.1.3.4， 100U/mg，AMRESCO Inc.)；牛血清白蛋白(BSA) 保定海泰克生物技术有限公司；β-D(+)-葡萄糖(分析纯) 北京瀛海精细化工厂；四甲氧基硅烷(>98%， TMOS) 武大有机硅新材料股份有限公司；溴代十六烷基三甲胺(CTAB) 北京化工厂；抗坏血酸(分析纯) 天津市医药公司；其它试剂均为分析纯。所有溶液用二次重蒸水配制。磷酸盐缓冲液含0.05mol/LKHzP04/ KHP04和0.1mol/LKC1。 果汁饮料均为市售。 LK98BⅡ微机电化学分析系统 天津兰力科化学电子高技术有限公司；研究电极采用直径为4mm的玻碳平板电极，对电极为直径1mm、长0.5cm的铂电极，参比电极为Ag/AgC1(饱和KC1溶液)电极。实验中的电位值均是相对于Ag/AgC(饱和KC1溶液)电极。 1.2 溶液的配制 精确称取经80℃干燥恒重的无水葡萄糖以含0.05mol/L KHP04/K2HP04和0.1mol/L KC1的缓冲液溶解，并移入50ml容量瓶中，稀释至刻度得0.5mol/L葡萄糖标准溶液。此溶液使用前需室温放置24h 使之完全转化为β-D(+)-葡萄糖，不用时储存于4℃冰箱中，10d内使用。 0.1mol/L过氧化氢溶液由1ml 30%(W)过氧化氢溶液稀释至100ml制得。 1.3 PB的电沉积14] 经Al20s粉末(0.5um)抛光的玻碳电极，依次经2mol/LNaOH、乙醇、2mol/LHC1 及二次水超声洗涤。将处理干净的玻碳电碳插入新配制的含2.5mmol/L FeCls、2.5mmol/L K3[Fe(CN)] 、0.1mol/L HC1和0.1mol/L KC1的溶液中，在恒电位0.4V下电沉积20s，即可制得PB膜修饰电极。将制得的电极置于含0.1mol/L HCl和0.1mol/L KCl 的溶液中，以0.05V/s的扫描速度在0.35~-0.05V之间扫描至稳定，取出电极，将其在100℃下烘干1h备用。在固定酶之前，在pH6.5的磷酸缓冲液中-0.05V活化10min，0.35~-0.05V之间循环伏安扫描10次。 1.4 酶电极的制备 将 2mg GOD 溶于200ul水中，取2ul滴于PB/GCE上，晾干30min。将新配制的二氧化硅溶胶-凝胶I12]6u1滴于修饰电极上，制得葡萄糖氧化酶电极(Si02/G0D/PB/GCE)， 放置10min， 然后置于潮湿气氛下于4℃冰箱中密闭保存，24h后使用。 同样的方法，以BSA代替GOD 制得二氧化硅膜固定BSA的PB修饰电极(Si02/BSA/PB/GCE)。 1.5 葡萄糖的安培检测 将制备的酶电极(Si02/GOD/PB/GCE)， Ag/AgCl参比电极和铂对电极置于含10ml磷酸盐缓冲溶液的电解池中，用磁力搅拌器搅拌，在室温条件下，工作电位-0.05V， 待背景电流稳定后注入不同量的葡萄糖标准溶液，记录酶电极对葡萄糖的安培响应，得到酶电极对葡萄糖浓度的校正曲线。然后酶电极在操作条件相同的情况下，待背景电流稳定后，注入待测的样品，记录电流响应。对于碳酸类饮料在测定前要先进行脱气处理，以除去C02气体。 2 结果与讨论 2.1 酶电极的制备、检测机理及检测条件 本实验制备的葡萄糖氧化酶电极测定葡萄糖含量依据下述反应： 制备的酶电极表面修饰具有“三明治”的结构，内层为对H202敏感的PB，中间是酶层，最外层是起固定酶及保护内层双重作用的二氧化硅溶胶-凝胶层。实验表明，这种结构具有一定的优势，构造酶电极需要的酶量小，固定的酶量易控制，固定酶的量影响酶电极的响应特性及稳定性。酶与PB层的紧密接触，使得酶促反应生成的H202可直接、快速的在PB上被电还原，因此这样的酶电极有高的灵敏性；酶促反应是特异专一的，选择性高，而PB对H202在低电位下的电催化还原，又避免了电活性物质的干扰，这种酶电极又具有高的选择性；；二氧化硅溶胶凝胶膜起到了保持酶活，防止泄露，提供生物兼容微环境等作用，使得酶电极稳定性好。 检测条件包括电解质缓冲液的pH值，温度，工作电位等。根据前期的研究I12]，在pH6.5的磷酸缓冲液(含 0.05mol/LLKKHP04/K2HP04和0.1mol/L /KC1)， 25℃， 恒定工作电位-0.05V下，进行安培检测。 2.2 干扰性实验 对于果汁饮品，除含大量水外，一般含有果汁原浆，糖，柠檬酸，维生素C，β-胡萝卜素，食用香精及其他添加剂等。基质成分比较复杂，可能对葡萄糖的测定构成干扰。针对可能存在的物质，6种可能的干扰物用于 Si02/G0D/PB/GCE 的选择性实验。对每个干扰物浓度为 1mmol/L溶液，以1mmol/L的葡萄糖标准溶液在Si02/GOD/PB/GCE上的响应为100，测定干扰物溶液在同一酶电极上的相对响应，结果见表1。图为酶电极在加入果糖、蔗糖和葡萄糖的计时电流图。实验结果显示葡萄糖氧化酶电极几乎不受这些物质的干扰。 Time 图1 酶电极对分别加入果糖(a)、蔗糖(b)、葡萄糖(c)的电流-时间曲线 Fig.1 Current-time recording at the enzyme electrode foradditions of fructose(a)， sucrose(b)，and glucose(c)， respectively 表1 干扰物实验结果 Table 1 Results of interference test 底物Substrate 相对响应Relative response (1.0mmol/L) (%) 葡萄糖Glucose 100 果糖 Fructose 0.00 蔗糖Sucrose 0.00 麦芽糖Maltose 0.00 乳糖 Lactose 0.00 抗坏血酸Ascorbic acid 1.05 柠檬酸Citricacid 0.00 作为对照实验，在完全相同的制备条件下，用BSA代替 GOD制备了对照电极(Si02/BSA/PB/GCE)， 用于样品基质物质中电活性干扰物的检测和对酶电极测定的校1正。首先，做了和Si02/BSA/PB/GCE 对H202的安培响应实验，两电极都得到同样的结果，既对H202有灵敏的电流响应，并在一定的H202浓度范围内呈线性关系。表明电极内的PB膜不会因外层膜是酶层，还是蛋白质层而改变其对H202的电化学催化活性。然后用这两支电极分别对加入不同量的标准葡萄糖溶液，做计时电流实验。Si0/G0D/PB/GCE可得到电流在不断加入葡萄糖时随时间增大的曲线(图2插图a)。而Si02/BSA/PB/GCE的 电流-时间曲线没有显示任何电流变化(图2插图b)。说明在Si02/BSA/PB/GCE情况下，底物并没被催化，由于没有H202电性性物质产生而没有响应信号。为了考察真实样品基质可能的电活性干扰，将 Si02/BSA/PB/GCE在缓冲液中，在测定电位及其他测定条件下，待背景电流趋于稳定时，加入待测样品果汁饮品，做安培检测得到电流响应记录，与相同条件的下Si02/G0D/PB/GCE对相同样品量的果汁的安培响应比列表2。表中数据表示样品基质对测定的干扰情况，基质产生的信号在鲜橙汁饮料中最大，也只有2%。说明本实验制备的酶电极的测定方法受干扰很小，选择性比较高。 表2 基质对测定的干扰实验结果 Table 2 Interference testing results of the matrix in real sample 样品 相对响应* 富含维C果汁饮料 1.2% 可口可乐 0.8% 鲜橙汁饮料 2.0% 苹果爽 1.5% 注：*相对响应：BSA电极与GOD电极在相同条件下，对相同量的同一种样品的安培响应的比值。 2.3 校正曲线的建立 插图 a为 Si0z/GOD/PB/GCE 间隔时间加入一定量标准葡萄糖溶液的电流-时间曲线。 插图b为Si02/BSA/PB/GCE间隔时间加入一定量标准葡萄糖溶液的电流-时间曲线。 a.Current-time curve of SiOe/GOD/PB/GCE to successive addition of glucose.b.b.Current-time curveof Si02/BSA/PB/GCE to successiveadditionof glucose. 图2 SiO2/GOD/PB/GCE对葡萄糖的校正曲线 Fig.2 Calibration curve of glucose for SiO2/GOD/PB/GCE Si02/GOD/PB/GCE在上述检测实验条件下，按1.5项下操作，分次加入葡萄糖时的计时电流曲线见图2插图a。该酶电极对葡萄糖的响应很快，在10s之内可达到最大响应的95%。酶电极对葡萄糖的校正曲线见图2。线性范围0~4.50mmol/L，线性方程为I(uA)=-0.004260+1.2032c(mmol/L)，相关系数r=0.9993，灵敏度高达1.203p A/mmol·L，根据信噪比为3的原则，酶电极的检测限为 0.03mmol/L。 2.4 样品测定及回收率实验 将制备的Si02/GOD/PB/GCE， 在检测条件下按安1.1.5项下操作，待背景电流稳定后，加入50ul果汁样品，得到电流响应值，通过校正曲线可计算出葡萄糖的浓度。测定结果列于表3. 表3 样品葡萄糖含量测定结果 Table 3 Assay results of glucose contents in beverages 样品 测得浓度 RSD% 样品含量* Sample Contents(mmol/L) (n=5) (mmol/L) 富含维C果汁饮料 0.674 4.32 134.8 可口可乐 0.731 2.70 146.2 鲜橙汁饮料 0.662 5.31 132.4 苹果爽 0.480 3.56 96.10 注：*样品含量由测得量乘以稀释倍数得到的。 在样品中加入一定量的标准葡萄糖溶液，按上述方法操作，计算回收率。结果见表4. 表4 酶电极对葡萄糖回收率实验结果 Table 4 Recovery results of the enzyme electrode to glucose 样品 原始量 加入量 测得量 回收率 n Original Added Found Recovery Sample (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (%) 可口可乐 5 0.585 0.500 1.096 102.1 鲜橙汁饮料5 0.530 0.500 1.051 104.2 3 结 论 制备的基于PB的葡萄糖氧化酶电极对果汁饮品中葡萄糖的分析研究，表明无论是样品基质还是已知电活性干扰物对分析结果几乎没有影响。回收率实验结果说明了该方法的可靠性。这种酶电极法对葡萄糖的测定可推广应用于其他食品分析。 ( 参考文献： ) ( 1 P R Tomas， M L Carman， S 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