拈痛丸中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱和延胡索乙素检测方案(毛细管电泳仪)

Joumal of Chinese MedicinalMaterials 第32卷第2期2009年2月·302· 表1 3批常规提取的有效成分提取率 杜仲叶重量 原料中绿原 原料中总黄 干粉重量 干粉绿原酸 干粉总黄酮 绿原酸的 总黄酮的 /Kg 酸含量/% 酮含量/% /Kg 的含量/% 的含量/% 提取率/% 提取率/% 20 0.45 2.85 2.65 1.12 9.84 32.98 45.74 20 0.45 2.85 2.81 1.24 10.62 38.72 52.35 20 0.45 2.85 2.76 1.26 10.11 38.64 48.95 表2 3批罐组动态逆流提取的有效成分提取率 杜仲叶重量 原料中绿原 原料中总黄 干粉重量 干粉绿原酸 干粉总黄酮 绿原酸的 总黄酮的 /Kg 酸含量/% 酮含量/% /Kg 的含量/% 的含量/% 提取率/% 提取率/% 20 0.45 2.85 4.72 1.60 11.14 83.91 92.25 20 0.45 2.85 4.65 1.71 11.14 88.35 90.89 20 0.45 2.85 4.59 1.59 11.66 81.09 93.89 3.3 两种不同工艺时间的比较 提取3批杜仲叶(每批20 Kg)，动态逆流提取所消耗的时间是传统提取方式的70%，更加节省时间。 4 小结 4.1 实验中并未对提取液进一步纯化处理，如过大孔树脂柱等，所以干粉中的总黄酮和绿原酸含量较低。但结果显示：与传统的单罐提取法相比，罐组动态逆流提取法应用于杜仲有效成分的提取，其产品收率高，有效成分含量高，质量好。同时其生产能耗少、成本低、周期短，更加经济节约。 4.2 近年来，罐组逆流提取技术相关的研究、专利及应用均有所增加，该技术之所以越来越受到重视，是因为其具有诸多优点：在保证提取率的基础上，可以使提取溶剂用量大大减少，能耗显著降低，这对降 低生产成本、减少环境污染具有十分重要的意义。此外，它对生产设备要求不高，大多数生产厂家，通过对现有的多功能提取罐进行设备改造，即可采用罐组逆流工艺进行提取。 ( 参 考 文 献 ) ( [1]李家实，阎玉凝.杜仲皮与叶化学成分初步研究[J]. 中药通报，1986，11(8)：41-42. ) ( [2]朱丽青，张黎明.杜仲叶和皮的药理实验[J].中草药， 1986，17(12)：15-17. ) ( [3]王坤.益母草罐组式动态逆流提取工艺研究[J].安徽 中医学院学报，2000，19(5)：46-47. ) ( [4]尉芹，王冬梅，马希汉，等.杜仲叶总黄酮含量测定方法 研究[J].西北农林科技大学学报，2001，29(5)：124-125. ) 毛细管电泳法测定拈痛丸中四种有效成分的含量 刘 丹，龚红全，毋福海 ，曾承辉 (广东药学院，广东广州510224) 摘要 目的：建立同时测定拈痛丸中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、延胡索乙素含量的方法。方法：采用毛细管电泳法。电泳条件：未涂层弹性融硅石英毛细管柱(55cm X75um D，有效长度47cm)；以 100 mmol/L磷酸二氢钠溶液+50%乙醇(pH5.70)为运行缓冲液；分离电压 21kV；重力进样5s(高度15 cm)；检测波长211 nm，结果：以盐酸麻黄碱为内标，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、延胡索乙素的线性范围分别为(8.0~64.0)mg/mL(r=0.9989)、(2.5~12.5)mg/mL(r=0.9997)、(0.4~3.2)mg/mL (r=0.9982)、(0.2~1.6)mg/mL(r=0. 9987)。结论：该法简便、快速、准确可靠，可用于拈痛丸的质量控制研究。 关键词 毛细管电泳；拈痛丸；盐酸小檗碱；盐酸巴马汀；盐酸药根碱；延胡索乙素 中图分类号：R286.02 文献标识码：A 文章编号：1001-4454(2009)02-0302-04 ( 收稿日期：2008-08-28 ) ( 基金项目：广东省自然科学基金资助项目(5002841) ) ( 作者简介：介丹(1985-)，女，硕士研究生，专业方向：现代分析方法在中药质量控制中的应用研究； Tel： 15989185729， Email：hamomobird@ 163.com。 通讯作者：毋福海，Tel： 13610124722，Email： fuhaiwu@163.com。 ) 拈痛丸为香港注册的中药成方制剂，由广藿香、延胡索、厚朴、木香、黄连、陈皮等18味中药制成，具有解表化湿、理气和胃、燥湿除满、温中止痛之功效。延胡索为方中君药，延胡索乙素为其主要有效成分，但采用 HPLC法进行含量测定研究时，阴性样品在延胡索乙素峰处有干扰。黄连中的有效成分为小檗碱、巴马汀、药根碱。为进一步对该制剂的质量控制进行研究，本实验采用毛细管区带电泳法，以盐酸麻黄碱为内标，同时测定了拈痛丸中盐酸小檗碱(1)、盐酸巴马汀(2)、盐酸药根碱(3)和延胡索乙素(4)的含量，方法简便、快捷、经济，可用于拈痛丸的质量控制。 仪器和试药 CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，德国 KNAUER K-2501紫外可见检测器，HW-2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)；OR DN MODEL 828型pH计(美国)；DL-360超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂)，工作频率4.5 KHz 5%，输出功率240W；未涂层弹性融硅石英毛细管柱(河北锐年永沣色谱器件有限公司)。 延胡索乙素对照品(中国药品生物制品定所，批号：110726-200409)；盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200609)；盐酸巴马汀对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110732-200506)；盐酸药根碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110733-200005，供鉴别用，经HPLC面积归一化法测定，纯度为98.8%)；盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：171241-200404)；拈痛丸(香港中港药业公司，每包1g，每盒12包)；磷酸二氢钠、乙醇、NaOH等均为分析纯，水为双蒸水。 2 实验部分 2.1 溶液的制备 2.1.1 内标溶液：精密称取盐酸麻黄碱一定量，加甲醇制成160mg/mL的内标贮备液。 2.1.2 对照品溶液：精密称取延胡索乙素对照品8.00mg置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(浓度为 80mg/mL)：精密称取盐酸小檗碱对照品20.0mg，置 25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(浓度为800 mg/mL)；精密称取盐酸巴马汀对照品 6.25mg，置 25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(浓度为250mg/mL)；精密称取盐酸药根碱对照品 8.10 mg，置 50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(浓度为160mg/mL)。 2.1.3 供试品溶液1的制备：取拈痛丸样品名10包，研碎，取约1g，精密称定，置25mL量瓶中，加入盐酸甲醇(1：100)约 20 mL，60℃水浴中加热15min，取出，超声处理30min，室温放置过夜，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液 0.45mm滤膜过滤，精密量取取液2.5mL至5mL量瓶中，加内标溶液 0.5mL，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液 1，用于盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱的测定。 2.1.4 供试品溶液2的制备：取拈痛丸样品10包，研碎，取约2g，精密称定，置250mL平底烧瓶中，加入浓氨试液三氯甲烷(120)约50mL，水浴中加热回流2h，放置冷却，摇匀，滤过，滤液在水浴上挥干，残渣加甲醇溶甲，定容至 5.0 mL， 0.45 mm滤膜过滤，精密量取取液2.5mL至5mL量瓶中，加内标溶液 0.5mL，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液 2，用于延胡索乙素的测定。 2.1.5 阴性对照液1的制备：取处方组成中除黄连外的其余成分制成不含黄连的阴性对照品，按“2.1.3"项下的制备方法处理得阴性对照液1。 2.1.6 阴性对照液2的制备：取处方组成中除延胡索以外的其余成分制成不含延胡索的阴性对照品，按2.1.4"项下备制备方法处理得阴性对照液2. 2.2 电泳条件 未涂层弹性融硅石英毛细管柱55cm X75 m D，有效长度47 cm；以100 mmol/L磷酸二氢钠溶液 +50%乙醇(pH5.70)为运行缓冲液；分离电压 21kV；重力进样 5s(高度15 cm)；检测波长211mm；温度25℃，湿度小于70%。毛细管柱在使用前依次用 0.1 mol/L NaOH溶液、水、运行缓冲液各冲洗约 5m in，样品分析间隔用运行缓冲液平衡2 min，运行每3h左右更换一次缓冲液。在此条件下，各组分间分离度大于1.5，阴性样品不干扰样品测定。分离情况见图1. 2.3 方法学考察 2.3.1 标准曲线制备：分别吸取的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱延胡索乙素对照品贮备液一定量，与内标溶液一定量，加甲醇稀释成含盐酸小檗碱浓度为8.0、16.0、32.0、48.0、64.0mg/mL，盐酸巴马汀浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mg/mL，盐酸药根碱浓度为0.4、0.8、1.6、2.4、3.2mg/mL，延胡索乙素浓度为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mg/mL与内标溶液浓度为16.0mg/mL的溶液。依次重力进样5s， 每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度(C)为横坐标进行线性回归，分别得回归方程Y=0.0978C+0.0505(r=0.9989)；Y =0.1013Cz +0.0269(r=0.9997)；￥=0.1129C； +0.0143 (r=0.9982)；Y=0.3084C4 +0.0468(r=0.9987)。表明盐酸小檗碱浓度在(8.0~64.0)mg/mL、盐酸巴马汀在(2.5~12.5)mg/mL、盐酸药根碱在(0.4~3.2)mg/mL、延胡索乙素在(0.2~1.6)mg/mL与峰面积线性关系良好。 0.5 0 -0.5 - HL.510 12 14 16 18 20 22 24 26 图1 对照品、样品及阴性的毛细管电泳色谱图 A.对照品 B.供试品1 C.阴性1 D.供试品2 E.阴性2 1.盐酸小檗碱 2.盐酸巴马汀 3.盐酸药根碱 4.延胡 索乙素 5.内标物 2.3.2 精密度试验：取浓度分别为32.0、7.5、1.6、0.8 mg/mL的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱与延胡索乙素对照品溶液，重力进样5s，连续测定5次，记录峰面积并计算 RSD。结果盐酸小檗碱的RSD=1.86%，盐酸巴马汀的 RSD=1.85%，盐酸药根碱的 RSD =2.95%，延胡索乙素的RRSD=2.25%，表明仪器精密度良好。 2.3.3 稳定性试验：取供试品溶液交(批号：CK20060701)在 0、2、4、6、8、10、12 h，分别重力进样56s，记录峰面积。结果盐酸小檗碱的汐 RRSD=2.36%盐酸巴马汀的 RSD=2.89%盐酸药根碱的RSD=2.44%延胡索乙素的 RSD=2.50%，表明供试品溶液在12 h内稳定。 2.3.4 重复性试验：取同一批号 (批号：CK20060701)样品6份，按“2.1.3”、、“2.1.4”项下方法提取、测定。结果盐酸小檗碱的平均含量为1.73 mg/g，RSD=2.35%(n=6)；盐酸巴马汀的平均含量为0.54mg/g，RSD=3.07%(n=6)；盐酸药根碱的平均含量为0.13 mg/g，RSD=3.10%(n=6)；延胡索乙素的平均含量为44.9mg/g，RSD=2.71%(n=6)。表明分析方法重复性良好。 2.3.5 加样回收试验：精密称取拈痛丸样品(批号：CK20060701)共6份，加入相应量的盐酸小檗碱、盐骏巴马汀、盐酸药根碱和延胡索乙素对照品，按"2.1.3”、“2.1.4"项下方法处理并测定，计算回收率。盐酸小檗碱的平均回收率为103.5%、RSD=2.15%；盐酸巴马汀的平均回收率为100.2%、RSD=2.81%；盐酸药根碱的平均回收率为102.8%、RSD=2.10%；延胡索乙素的平均回收率为97.8%、RSD=1.98%。结果表明方法准确、可靠。 2.4 样品测定 取拈痛丸3批，按 “2.1.3”、“2.1.4”项下方法处理后测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱与延胡索乙素的含量，结果见表1. 3 讨论 3.1 检测波长的选择 用甲醇配制的标准液进行紫外扫描测得：盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱三者都在220、280、335 nm附近处有相似的最大吸收峰；而延胡索乙素、盐酸麻黄碱在211、280 mm处有最大吸收峰，但在280mm处延胡索乙素检测灵敏度低，考虑到拈痛丸中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱的含量远大于延胡索乙素，为能在同一体系下同时检测，故选择延胡索乙素最大吸收波长处即211nm作为检测波长。 3.2 内标物的选择 为克服毛细管电泳重现性差 的缺点，本文采用内标法定量。盐酸麻黄碱在211nm处也有最大吸收，而且能与四种目标检测物基线 分离，对其它未知峰也无干扰，综合相似性和经济性[4，5]原则，选择盐酸麻黄碱为本实验内标物 表1 样品测定结果(n=3) 批号 盐酸小檗碱 RSD 盐酸巴马汀 RSD 盐酸药根碱 RSD 延胡索乙素 RSD 含量/(mg/g) /% 含量/(mg/g) /% 含量/(mg/g) /% 含量/(mg/g) /% CK20060601 1.56 1.82 0.48 2.81 0.12 1.39 3.6 2.84 CK20060701 1.73 2.35 0.54 3.07 0.13 3.10 4.9 2.71 CK20060801 1.30 1.68 0.4093 2.91 0.11 1.86 5.7 2.78 3.3 提取方法的选择 延胡索乙素在拈痛丸中的含量极低，远小于其它3种目标生物碱，而且其极性也远低于其它3种目标生物碱，所以采用同一提取方法很难完全将4种物质同时提取出来，只能分别采用不同的提取方案。前3种生物碱可以采用盐酸甲醇加热超声提取，而延胡索乙素则采用三氯甲烷加热回流浓缩提取，证明效果较佳。 3.4 电泳条件的选择 3.4.1 缓冲液种类的确定：鉴于目标检测物都为碱性较强的季铵类或叔铵类生物碱，故应选用弱酸性的缓冲体系，经实验发现磷酸二氢钠溶解性能好，电导率低，可有一个宽的浓度选择范围。分别考察磷酸二氢钠浓度对测定的影响，在20 mmo1/L~160mmol/L，发现只有当磷酸二钛钠浓度大于1100mmo1/L时，离子浓度高，电电势小，保留时间长，分辨能力强，才能将峰]1、2、3、5完全基线分离，而离子浓度越大，电流也越大，焦耳热越严重，故选择磷酸二氢钠的浓度为100 mmol/L。 3.4.2 缓冲液溶剂介质的确定：当溶剂介质完全为水时，水本身的摩尔电导率太大，电流过高，75mm毛细管无法承受，故必须加入适当比例的其它摩尔电导率低的介质。磷酸二氢钠浓度为100 mmol/L时，水的比例必须大于40%才能完全溶解，而大于60%电流过高导致基线不平，故介质中水的比例最好在此范围内。当使用甲醇时，电流低，但盐酸小檗碱和盐酸麻黄碱完全重叠，分不开。当使用乙腈时，保留时间短，8min就可以将5种物质完全分离，但峰展宽严重，柱效低，且峰间隔小，明显与样品中其它未知峰发生了重叠，不为单纯的该物质峰。只有使用乙醇时，因为其介电常数小，粘度大，所以电渗淌度小，保留时间长，分离度高，5种生物碱能达到基线分离，且与其它未知峰不重叠。 3.4.3 有机添加剂比例的确定：当磷酸二氢钠为 100 mmol/L和水的比例范围为40%~60%确定后，则对乙醇的比例在40%~60%间进行考察，实验发现只有当乙醇比例为50%时，既能基线分离5种目标峰，又有最短的保留时间。 3.4.4 电压的确定：在缓冲体系确定为100 mmol/L磷酸二氢钠+50%乙醇时考察电压12~24 kV，综合基线平滑度、峰展宽、柱效、分离度、保留时间考虑，最后确定分离电压为21 kV. 3.4.5 缓冲液的配制和更换规律：精密称定3.9g磷酸二氢钠，置250mL量瓶中，加50%乙醇溶解，超声15 min，过 0. 45 mm滤膜过滤，测其 pH值为5.70，作为运行缓冲液。 因为乙醇的挥发性强，随着时间的推移，电流增大，保留时间变短，分离度降低，所以必须保证缓冲液的前后一致性，实验发现约3h更换一次缓冲液基本可以满足要求。 ( 参 考 文 献 ) ( [1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上册.上海：上海科 学技术出版社，1998：919. ) ( [2]田智勇，李振国.黄连的研究新进展[J].时珍国医国 药，2004，1 5 (10)：704-706. ) ( [3]丁晴，徐德然.HPLC法同时测定黄柏中盐酸药根碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱的含量[J].西北植物学报， 2004，24(11)：2143-2145. ) ( [4]张国华，王延琮，张永友，等.高效毛细管电泳测定黄连及成药中小檗碱型生物碱的含量[J].色谱，1995，13 (4)：247-249. ) ( [5]戴开金，罗奇志，罗佳波，等.葛根芩连方药中小檗碱、药根碱和巴马汀的高效毛细管电泳分析[J].第一军医 大学学报，2003，23(7)：683-685. ) ( [6]卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部. 北京：化学工业出版社，2005：213-214. ) ( [7]陈义.毛细管电泳技术及应用[M].北京：化学工业出 版社，2000：47-48. ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. 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