氯化血红素片剂中氯化血红素检测方案(液相色谱仪)

第27卷增刊2008年5月Vol.27. Suppl.2008- 5分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第27卷增刊2008年5月Vol.27. Suppl.Sur2008-5 HPLC 法测定氯化血红素片剂的含量 霍仕霞，闫目 明日*2.，黄 毅，张兰兰，刘晓东 (1.新疆石河子大学药学院，石河子832000；2.新疆维吾尔医药研究所，乌鲁木齐830049；3.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐830002) 摘 要：建立高效液相色谱法测定氯化血红素片中的氯化血红素含量。采用Shimadzu VP-Ci8 (150 mm X4.6 mm， 5 um)；流动相为V(甲醇、乙腈、水、醋酸)：V(吡啶)=40.040.0：19.0：1.0：0.6流速：1mL/min；柱温：355℃：检测波长：399 nm。氯化血红素在0.2034~2.034 ug/mL 范围内呈良好的线性关系， r=0.9998，平均回收率为96.83%， RSD=1.24%。本方法可用于该制剂的质量控制。 关键词：氯化血红素；高效液相色谱法；二极管阵列检测器；含量测定 氯化血红素，又名氯高铁血红素，氯化铁卟啉，氯高铁原卟啉IX， 高铁原卟啉，高铁血红素等。从牛血、羊血及猪血中提取，分子式为 C34H2ClFeN404，其结构是一个铁螯合物，性质较稳定，结构见图1. 氯化血红素是一种生物铁，作为缺铁性贫血的天然补品及药物原料，它能被人体很好的吸收，无毒副作用，是现代医学公认的防治缺铁性贫血、吸收率高、效果好的生物铁源，无铁腥味，不刺激胃肠，具有较好应用开发前景。 图1 目前国内文献报道氯化血红素的含量测定的方法，大多采用紫外分光光度法，本文采用 HPLC/DAD 法测定氯化血红素片剂中氯化血红素的含量，取得了满意的结果。 实验部分 1.1 仪器与试剂 Shimadzu LC10 Avp 高效液相色谱仪，CTO-10Avp检测器，Class-VP色谱工作站， BP211D 电子天平(Sartorius)， PB-10pH计(sartorius)。 甲醇、乙腈为色谱纯，醋酸、吡啶均为分析纯，水为重蒸水。 氯化血红素(Hematin Chloride)对照品由 Fluka公司提供，含量>98%；氯化血红素片(规格30mg/片，批号：020706，020707，020708)由新疆华丰源技术开发公司提供；辅料：微晶纤维素、硬脂酸镁、甘露醇等。 1.2 色谱条件及测定方法 Shimadzu VP-Ci8 (150 mm X4.6 mm)，流动相：V(甲醇：(乙腈)：V(水)：V(醋酸)：V(吡啶)=40.0：40.0：9.0：1.0：0.6；流速1mL/min；柱温：35℃；检测波长399nm；进样量：20匹L。 2 溶液的制备 2.1 供试品溶液的制备 取供试品0.250g(约相当于氯化血红素10mg)，精密称定，置500 mL容量瓶中，用0.1 mol/L ( * 基金项目：国家中小企业创新基金(03C26216500444)项目资助 ) ( 作者简介：霍仕霞(1983-) ， 女，研究生； E-mail： yanming21cn @sohu. com、huoshixia1983 @163. com ) 的 NaOH溶解并稀释至刻度，精密量取对照品的5mL置100mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度。 2.2 对照品溶液的制备 取对照品10mg，精密称定，置500 mL 容量瓶中，用0.1 mol/L 的 NaOH溶解并稀释至刻度，精密量取对照品的5mL 置100mL 容量瓶中，甲醇稀释至刻度。 3 标准曲线和线性范围* 取对照品10 mg，精密称定，置500mL容量瓶中，用0.1 ml/L NaOH溶解至刻度，分别取此对照品的碱液1、3、5、7、10mL 置100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，进样20uL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得线性方程为y=179857x+21101=0.9998；表明氯化血红素的浓度在0.2034~2.034 ug/mL范围内线性关系良好。 4 检出限和定量限 在选定色谱条件下，按S/N为3时，对最低检测限进行测定，得氯化血红素的检测检为72 ng/mL； S/N为10时，对最低检出限进行测定，得氯化血红素的定量限为164 ng/mL 。 5 精密度试验(重复性、中间精密度) 5.1 重复性 在相同操作条件下同一人在短时间内测定结果的精密度。配制3个不同浓度的供试品溶液，每个浓度下取3份供试品，进行含量测定，结果RSD为0.22%。 5.2 中间精密度(重复性、中间精密度、重现性) 分别不同日期、不同的操作人员、不同的设备下测定氯化血红素片剂的含量，结果 RSD 分别为1.56%、0.44%、0.28%。 6 稳定性试验 取“2.1”项下氯化血红素的对照品溶液，在配制当天每隔0、1、2、4、8、10h进样1次，考察日内差异， RSD为1.59%(n=6)；并于配制后连续3天进样，考察日间差异， RSD 为1.79%(n=4)。 7 回收率实验 取同一批号已测含量的样品(批号020707)，按供试品制备项下制备供试品，称样量减半，在线性范围内选取高、中、低浓度分别为3、5、7mg3个浓度，按供试品制备项下操作，进样量20uL， 结果平均回收率为96.83%， RSD=1.24%(n=6). 8 空白对照实验 阴性对照溶液的制备精密移取0.1ml/L的NaOH溶液5mL 置100mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，作为阴性对照溶液，在相同的色谱条件下，进样20匹L，得色谱图见图2. 图2 对照品(a)、供试品(b)、阴性对照(c)色谱图 9 氯化血红素片剂含量测定 精密量取供试品和对照品，按溶液制备项下分别供试品溶液和对照品溶液。分别吸取供试品溶液和对照品溶液20uL，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得，结果见表1。 表1 样品含量测定结果((n=3) 批号 含量测定(标示量/%) 020706 98.67 020707 98.86 020708 98.42 10 讨论 10.1 检测方法的选择 目前国内文献报道氯化血红素的含量测定方法，大多采用紫外分光光度法，本实验中采用HPLC/DAD 法易于监测氯化血红素中的有关物质，为质量标准的制定提供依据，故采用 HPLC法。 10.2 溶剂的选择 因氯化血红素溶于碱，通过稳定性考察，在碱性条件下，氯化血红素有降解产物生成，对不同浓度 NaOH进行考察，结果0.1 mol/L的 NaOH作为溶剂最佳，又考虑到氯化血红素在碱中的稳定性差，故样品配制时，先用0.1 mol/L 的NaOH溶解，再用甲醇稀释至所需浓度进行测定. 10.3 色谱柱的选择 试验中曾选用 YMC-pack ODS-Ci8 150 mmX6.05 um； ShimadzuVP-C： 150 mm ×4. 65 um 和 YMC-pack ODS-Ci： 150 mm X4.6 5um 进行分离试验。结果 Shimadzu VP-Ci： 150 mm ×4.65 {m分离效果最佳。 10.4 流动相的选择 氯化血红素是一个含有两个羧基的酸性化合物，因此流动相的选择对分离测定具有非常大的影响。比较了V(甲醇)：V(乙腈)：V(水)：V(醋酸)：V(吡啶)的比例分别为40.040.0：19.0：1.00.4) (40.040.0：19.0：1.010.5)((40.0：40.0：19.0：1.0：0.6)的3种系统，证实第3种作为流动相分离效果最好，所以确定以V(甲醇)：V(乙腈)：V(水)：V(醋酸)：V(吡啶)=40.040.0：19.01.01.6为本法的流动相。 ( 参考文献 ) ( 李兴春.中国生化药物杂志，1993，4： 59 ) ( 2] 于茂泉，宫爱君.上海预防医学杂志，2004，16(9)： 424 ) ( 袁 曦，洪 清，陈 樱，中国药房，1994，5(6)：36 ) ( 中国药典(二部).2005. . Ⅱ ： Appendix(附录)VID ) —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net