新疆红景天根中总黄酮检测方案(液相色谱仪)

Vo1.27.Suppl.2008-5第27卷增刊2008年5月分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第27卷增刊2008年5月Vol.27. Suppl.2008-5 HPLC法测定新疆红景天根中总黄酮的含量 芦启琴1，杨晓艳12，张晓峰*1 (1.中国科学院西北高原生物研究所，西宁810008；2.中国科学院研究生院，北京100049) 摘 要：建立测定红景天根中总黄酮含量的 HLC法。采用 Theiuo-C8(4.6 mmx200 mm， 5 um)为色谱柱，V(甲醇))：V(0.4%HPO4溶液)=5050为流动，流速1.0 mL/min，检测波长360 nm，柱温255℃。檞皮素、山奈酚、异鼠李素的线性范围分别为0.0128~0.0384、0.24~0.48及0.12~0.44 ug；平均回收率分别为106.30%(RSD=1.97%)、102.30%(RSD=1.69%) 和100.90%(RSD=1.62%)。所建立的 HPLC法可用于测定红景天属植物中总黄酮的含量. 关键词：红景天；总黄酮； HPLC 红景天是景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodida)植物，其根、根茎或全草既可作药用也可用作保健食品。红景天有“高原人参”美称，具有滋补强壮、抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗癌、延缓衰老及适应原样等作用。目前，已从红景天属植物分离的主要成分有红景天苷及其普元酪醇、黄酮类、没食子酸及其苷类、草质素及其苷类等]。新疆有多种红景天，其中以狭叶红景天(Rhodiola kirilowii Rgl. ex Maxim.)为主要品种。近年药理实验表明，红景天黄酮类化合物具有抗病毒、抗肿瘤、强心、降压、扩张冠状动脉、降低胆固醇、利尿、止咳祛痰、保肝等作用。对于总黄酮含量的测定多采用比色法，用 HPLC法测定红景天中总黄酮成分含量的报道尚未见，本文参考中国药典银杏叶总黄酮含量测定方法，以皮素、山柰酚、异鼠李素为对照品，建立了 HPLC法测定红景天中总黄酮含量的方法，本方法简便准确，为红景天的有效利用及在新的药用领域的运用提供理论依据。 实验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent1100 高效液相色谱仪：Thermo-Ci8(4.6mm ×200 mm， 5 um)色谱柱， Agilent1100 G1315A二极管阵列检测器，Agilent 1100 G1311A四元泵，Agilent 1100配套化学工作站。KQ-250DE超声波清 洗器(昆山市超声仪器有限公司)，METILERTOL EDO XS205 电子天平。 对照品：皮素(批号：0081-9304)、山奈酚(批号0861-9901)、异鼠李素(批号860-200103)由中国生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。红景天样品由我所张晓峰研究员鉴定为红景天干燥根。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱： Thermo-Ci8(4.6 mm X200 mm， 5 um)，流动相：V(甲醇)：V(0.4% H，PO4)=50 50，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长360nm，进样量20uL。对照品及样品在此色谱条件下的色谱图，见图1~图4. 图1 檞皮素对照品色谱图 ( * 作者简介：芦启琴(1981-)，女，硕士研究生； E-mail： luqiqin05 @126. com ) 图2 山柰酚对照品色谱图 图3 异鼠李素对照品色谱图 图4 红景天药材祥品色谱图 2.2 样品溶液的制备 将本品根粉碎，过60目筛，700℃烘干至恒重。精密称取3g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇60mL，密塞称重，超声处理1h，取出冷至室温，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液减压浓缩至干，加V(甲醇)：V(25% HCI)=4：120mL溶解残渣，水解30 min，定容置20mL容量瓶中，以0.45 um膜膜过滤，作为样品溶液。 2.3 对照品溶液的制备 精密称取檞皮素对照品1.60 mg，山奈酚对照品0.3 mg， 异鼠李素对照品0.2mg，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.16、0.03、0.02 mg/mL 的对照品溶液。 2.4 标准曲线制备 精密吸取“2.3”配制的皮皮素对照品溶液稀释50倍，配制成0.0032 mg/mL 的对照品溶液，分别精密吸取4，6，8，10，12uL，进样，按上述色谱条件测定，以峰面积对檞皮素进样量做线性回归。同上分别精密吸取“2.3"配制的山奈酚对照品溶液(8，10，12，14，16uL)、异檞皮素对照品溶液(6，10，14，18，22uL)，进行测定，求回归方程。上述槲皮素、山奈酚、异鼠李素回归方程分别y=3140.6x-2.4， r=0.9995；y=3498.8x-47.48，r=0.9995；y=933.92x+27.577，r=0.9996. 结果表明皮素进样量在0.0128~0.0384pg，山奈酚进样量在0.24~0.48ug，异鼠李素进样量在0.12~0.44pg范围内与峰面积具有良好的线性关系。 2.5 精密度试验 精密吸取“2.3”配制的3种对照品溶液10uL，各重复进样5次，按上述色谱条件操作，测峰面积，以峰面积计算RSD 分别为 0.32%，0.32%，0.56%，结果表明，本方法精密度良好。 2.6 重现性试验 分别精密称取同一批次样品0.5g，按“2.2“样品溶液的制备方法制备6份供试液，进样，按上述色谱条件分别测定槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量。皮素平均含量为0.0010%， RSD 为2.0%；山奈酚平均含量为0.0131%，RSD 为0.90%；异鼠李素平均含量为0.0105%， RSD 为1.0%，结果表明，本方法重现性良好。 2.7 回收率试验 取“2.6"项下样品，精密称取6份(各1.5g)，精密加入槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品(0.0049，0.2100，0.1550 mg/mL)各1mL，测定结果见表1、表2、表3。三者 RSD 分别为1.97%、1.69%、1.62%。 2.8 样品测定 分别取不同批次红景天样品按样品溶液制备方法处理后在上述色谱条件下测定，以外标法计算含量，结果见表4。按公式计算红景天中总黄酮醇苷含量31，总黄酮醇苷含量=(皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量)X2.51，总黄酮醇苷平均含量为0.0617%(n=3)。 样品含量/mg 加皮素的量/mg 测出总含量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 0.004682 0.0049 0.009869 105.49 106.30 0.004683 0.0049 0.010020 108.57 0.004683 0.0049 0.009968 107.52 1.97 0.004682 0.0049 0.009827 104.64 0.004682 0.0049 0.009769 103.45 0.004684 0.0049 0.010000 108.21 表2 山奈酚回收率率验结果(n=6) 样品含量/mg 加山奈酚的量/mg 测出总含量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 0.20926 0.210 0.42115 100.90 102.30 0.20937 0.210 0.42727 103.76 0.20932 0.210 0.42352 102.00 1.69 0.20943 0.210 0.42808 104.12 0.20936 0.210 0.41883 99.80 0.20925 0.210 0.42656 103.43 表3 异鼠李素回收率实验结果(n=6) 样品含量/mg 加异鼠李素的量/mg 测出总含量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 0.1586 0.155 0.30912 99.52 100.90 0.15480 0.155 0.30786 98.75 0.15488 0.155 0.31323 102.16 1.62 0.15489 0.155 0.31473 103.12 0.15486 0.155 0.31201 101.39 0.1585 0.155 0.31095 100.71 表4 样品含量测定结果 样品 槲皮素含量 山奈酚含量 异鼠李素 总黄酮 编号 /% /% /% /% 0.001025 0.0131 0.0103 0.0613 0.001013 0.0132 0.0108 0.0628 3 0.001033 0.0129 0.0104 0.0611 3 讨论 (1)比较甲醇、乙醇、2.5mol/L盐酸甲醇溶液，V(甲醇)：V(0.5%醋酸)=4：1溶液等不同的提取溶剂，结果表明以甲醇提取的黄酮含量较高，色谱峰的峰形好，且分离效果亦好。 (2)超声技术已经广泛应用于总黄酮的提取，可以大幅度地提高总黄酮的提出率，极大地缩短提取时间，节省溶剂。超声提取一般在常温条件下进行，避免了黄酮的分解。在本实验中，我们曾 比较超声1h、回流2h及索氏提取4h这3种提取方法，实验表明3种方法总黄酮提取率没有明显差异，考虑到超声提取方法简单，耗时短，所以选择超声提取法。 3)目前有关红景天黄酮类化合物的含量测定只有传统的比色法，我们首次应用 HPLC法对红景天中总黄酮的含量进行测定，该方法简便易行、灵敏准确、重现性好，可为红景天药材中总黄酮的含量分析提供一个很好的色谱参考条件。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 宋月英，马玉珍，韩慧文等.中草药，2004，35(2)： 235 ) ( 2] 王家明，阎继平.中医药学报，2003，31(4)：57 ) ( 31 国家药典委员会.中国药典(一部).北京：化学工业 出版社，2005. 2 20 ) ( 4 彭 曦. 时 珍国医国药，2005，16(12)：1251 ) —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net