红血球中6巯基嘌呤及其代谢产物检测方案(液相色谱仪)

FYYSWQT0002 急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6巯基嘌呤及其代谢产物的HPLC分析 F_YY_SW_QT_0002 急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6-巯基嘌呤及其代谢产物的HPLC分析 6-巯基嘌呤 (6-mercaptopuring，6-MP)和硝基咪唑硫嘌呤 (a(zathiopurine， Aza) 主要作为抗肿瘤药用于治疗急性淋巴细胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia， ALL)， 或者作为免疫抑制剂用于治疗炎性肠病、风湿关节炎、系统性红斑狼疮和抑制器官移植病人的急性排斥。 Aza 是 6-MP 的1-甲基-4-硝基-5咪唑硫衍生物，在体内降解生产6-MP， Aza 抗肿瘤和免疫抑制的药物活性主要是来自其降解产物6-MP的代谢产物。 图 1.I.66-巯基嘌呤的代谢 6-MP在体内的代谢主要有三条途径：(1)在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase， HGPRT)的作用下转化为6一硫次黄嘌呤核苷一磷酸(6-thioinosine monophosphate， TIMP)， TIMP 随后在一系列酶促反应中 转化为活性代谢物6-硫鸟嘌呤核苷 (6-thioguanine nucleotides，6-TGNs) 发挥细胞毒作用；(2)在硫嘌呤甲基转移酶 (thiopurine methyltransferase，TPMT) 作用下转化为无药物活性的甲基硫嘌呤 (6-methylmercaptopurine， 6-MMP)；(3)在黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase， XO) 作用下转化为6-硫尿酸(6-thiouric acid，6-TUA) ，见图1。 与6-MP转化为活性代谢产物性6-TGNs 相竞争的有两条途径：在 TPMT 作用下转化为 6-MMP 和在 XO 作用下转化为 6-TUA。 XO 活性在个体之间的差异不大，而TPMP 活性在不同个体之间有很大的差异。因而病人对6-MP反应(即药物的疗效和毒性)的差异主要决定于其体内 TPMT的活性。已经发现红细胞中6TGNs 的含量与 TPMT的活性呈负相关关系。在标准用药剂量下， TPMT 活性低的个体能积累高浓度的6-TGNs导致致死性的骨髓细胞毒性。相反 TPMT 活性高的个体对硫嘌呤类药物可能没有反应，因为它们很快就被转化为无活性性 6-MMP。因而通过监测接受硫嘌呤类药物治疗的病人血红细胞内6-MMP 和6-TGNs 的水平，据此确定准确的用药剂量，对提高治疗效果、减小药物毒副作用是非常关键的。在本项目的资助下，我们与广州医学院第一附属医院合作，研究建立了急性淋巴细胞白血病患者红血球中6-MP 及其代谢产物的高效液相色谱分析方法，为6-MP个性化治疗提供基础。 实验 1.1仪器与试剂 6-巯基嘌呤 (6-mercaptopurine， 6-MP)、6一硫鸟嘌呤 (6-thioguanine， 6-TG)、6-硫黄嘌呤 (6-thioxanthine， 6-TX)、6-甲基硫嘌呤 (6-methyl mercaptopurine， 6-MMP)、戊醇、乙酸苯汞 (phenyl mercury acetate， PMA) 和二硫苏糖醇 (DL-dithiothreitol，DTT) 为 Sigma公司产品；甲醇、甲苯为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 高效液相色谱仪：岛津LC-6A， 配LC-6A高压输液泵、柱温箱、SPD-6AV 可变波长紫外-可见分光检测器、系统控制器、CR-3A积分仪和色谱工作站。 1.2试剂配制 (1)PMA-戊醇-甲苯溶液的配制：取1.85 mL 戊醇，加入1000 mL 甲苯中，摇匀，再加入0.5 gPMA，轻轻搅动1h使 PMA 溶解，置于暗处保存。此溶液含 PMA 1.3 mmol/L，含戊醇170 mmol/L。 2)3.75 mmol/L DTT 水溶液配制：取289.2 mg DTT溶于500 mL水中。 (3)0.5 mol/L H2SO4。 (4)33.4mol/LNaOH。 (5) 0.1 mol/L HC1. 1.3标准溶液配制 分别取16.8 mg 6-TG、16.6mg6-MMP、17.0 mg 6-TX 和17.1 mg 6-MP 溶于水中并定容于 100 mL， 此溶液为贮备液Ⅰ，含每种硫嘌呤1.00 imol/mL。取10 mL贮备液I，稀释至100 mL，为贮备液II，含每种硫嘌呤100 nmol/mL；用贮备液Ⅱ稀释成1 nmol/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL 和20 nmol/mL 的系列标准溶液备用。 1.4样品处理 (1)血红细胞制备：采集正在接受硫嘌呤治疗的病人全血样本，肝素锂抗凝，室温下1000 g离心10 min， 弃去血浆和白血胞，红细胞以2倍体积的生理盐水洗涤两次，最后红细胞重新悬浮于生理盐水中，使红细胞的浓度约为810°细胞/200{IL。取少量作红细胞的准确计数，其余在-20℃下保存至分析。 (2)样品提取：200iL血红细胞(约含8310°红细胞)加入有800 iL3.75 mmol/LDTT 的 10 mL螺旋口试管中，再加入500 IL 0.5 mol/L 的HzSO4，盖紧，置于100℃烘箱中水解1h。在这一步中，硫嘌呤核苷水解转化为相应母体硫嘌呤和甲基硫嘌呤，如6-TGNs 水解生成6-TG、6-TIMP 水解生成6-MP、6甲甲基巯基嘌呤核苷转化为6-MMP，硫嘌呤和甲基硫嘌呤可以和乙酸苯汞形成复合物而被有机溶剂萃取出来。水解物冷却后，向水解管中加入500 iL 3.4 mol/L 的 NaOH后立即加入6mLPMA-戊醇一甲苯溶液，振荡10 min，离心。吸取5 mL 甲苯相于具塞离心试管中，加入200 iL0.1 mol/L HC1，在旋转混合器上混合3 20s，离心，弃去上层甲苯相，取水相50iL注入色谱仪进行于HPLC 分析。 1.5色谱条件 色谱柱：C18反相柱。 流动相A： 0.2%的乙酸-水溶液；流动相B：甲醇。 梯度洗脱程序：其中0~16 min 为分析梯度，四种物质在16min 内全部出峰，16~15 min 为洗色谱柱的时间。 检测波长：0~12.5 min波长为340nm，检测6TG、6-MP 和6-TX；12.5 min后切换到290 nm， 检测6-MMP。 柱温：40℃。 流速：1.0mL/min。 进样体积：10{iL. 2结果 2.1色谱图 在上述色谱条件下， 6一TG、6-MP、 6-TX和6-MMP 混合标准溶液的色谱图见图2，四种物质出峰的时间依次为9.26、9.96、10.84和15.57 min。 从图2可以看出，色谱分离状况良好，峰形对称，四种物质均达到基线分离，分离度≥1.5。 图2.梯度洗脱分析6-MP及其代谢产物的高效液相色谱图 色谱柱： C18；流动相流A： 0.2%的醋酸，流动相B：甲醇；梯度：0min 时， 100%A， 16min时， 20%A+80%B， 检测器：0~12.5 min 为 340 nm，检测6-TG、6-MP、 6-TX，12.5 min 以后切换为290 nm，检测6-MMP；柱温：40℃；流速：1.0mL/min。进样量：每种物质100 pmol/10 {iL。保留时间： 6-TG，9.26 min； 6-MP 9.96 min， 6-TX 10.85 min；6-MMP， 15.57 min。 2.2标准曲线 将1 nmol/mL、2nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL 和20 nmol/mL 的 系列混合标准溶液进样10iL，得到每种物质的峰面积，峰面积对进样量进行线性拟合，拟合结果见表1和图3。本方法对红血球中10 pmol/8 10° RBC 含量水平的6-TG、6一MP、 6-TX和6-MMP可进行准确地检出和定量分析，满足临床应用的要求。 表1.6-TG、6-MP、6-TX和6-MMP的标准曲线及线性拟合参数 进样量 峰面积 pmol 6一TG 6一MP 6-TX 6一MMP 10 1023 880 2669 961 20 1825 1732 5838 1986 50 4423 4032 11095 4639 100 9051 8256 23232 9435 150 14092 12985 33793 13621 200 18907 16629 43016 19012 Y=aX+b y=94.5x-130.2 y=84.1x-9.4 y=213.5x+1077.7 2 0.9993 0.9989 0.9980 0.9989 图3. 6-TG、6-MP、6-TX和6-MMP的标准曲线 2.3精密度和准确度 向未接授硫嘌呤治疗的健康人红血球中加入低、中和高三个浓度的混合标准溶液， 然后按照1.4的方法进行处理，按1.5的方法进行色谱分析，平行5份样品，计算每个标准加入水平下的回收率及其变异系数，结果见表2. 表2. 6-TG、6-MP、6-TX和6-MMP分析的精密度和准确度 加入量 批内(n=5) 批间(n=5) (pmol) 测得量 回收率 RSD 测得量 回收率 RSD (pmol) (%) (%) (pmol) (%) (%) 平均值±SD 平均值±SD 6-TG 20 19.2 土 0.9 96.0 4.7 19.1 士 1.5 95.5 7.9 50 48.1 土 2.1 96.2 4.4 47.3 士 4.7 94.6 9.9 200 188.1 土 4.6 94.1 2.4 194.4 土 11.3 97.2 5.8 6-MP 20 19.7 士 0.9 98.5 4.6 19.2 土 1.4 96.0 7.3 50 49.3 士 2.2 98.6 4.5 47.9 土 4.1 95.8 8.6 200 194.5 土 5.6 97.3 2.9 194.4 土 12.3 97.2 6.3 6-TX 20 19.4 土 0.7 97.0 3.6 19.0 土 1.4 95.0 7.4 50 48.9 士 2.3 97.8 4.7 48.5 土 4.5 97.0 9.3 200 195.3 土 7.3 97.7 3.7 190.4 土 12.3 95.2 6.5 6-MMP 20 19.2 土 0.8 96.0 4.2 19.1 土 1.5 95.5 7.9 50 49.4 土 2.0 98.8 4.0 47.3 土 4.7 94.6 9.9 200 196.3 土 7.6 98.2 3.9 194.4 10.4 97.2 5.3 2.4样品分析结果 在建立上述能同时分析6-TG、6-MP、6-TX和6-MMP等4种物质的 HPLC方法之前，我我首先建立了前3种物质6-TG、6-MP和6-TX的 HPLC 方法。本方法采用等度洗脱，具体如下：色谱柱：：C18；流动相为10：90的甲醇一水，含100mmol/L三乙胺并用磷酸调pH值为3.2，脱气前加入0.5 mmol/L 的 DTT； 流速：1.0 ml/min；检测波长：：335nm。色谱图见图4. 从图4可以看出，6-TG、6-MP和6-TX在等度洗脱的条件下，在8min 内得到了很好的分离。方法的线性、精密度和准确度均满足要求。但用这个方法，在我们的实验条件下，6-MMP 不易出峰。我们用等度洗脱方法，分析了正在接受硫嘌呤药物治疗的 ALL 患者的49份血样，典型的色谱图见图4B。以正常健康人的血样为空白对照，其色谱图见图4C，分析结果见表3。 图 4. 等度洗脱分析6-TG、6-MP 和 6-TX的高效液相色谱图 A-混合标准，B-正在接受硫嘌呤药物治疗的 ALL 患者血样， C-正常健康人的血样。色谱柱：C18；流动相为10：90的甲醇一水，含100mmol/L 三乙胺并用磷酸调 pH值为3.2，脱气前加入 0.5 mmol/L 的 DTT；流速：1.0 ml/min；检测波长：335 nm。保留时间： 6-TG，4.72 min； 6-MP， 5.46 min； 6-TX， 7.17 min。 表3. 接受硫嘌呤药物治疗的 ALL 患者红血球中 6-TG、6-MP 和6-TX的等度洗脱高效液相色谱分析结果(单位： pmol/8 10°RBC) No 6-TG 6-MP 6-TX No 6-TG 6-MP 6-TX 0 <10 <10 27 <10 <10 <10 2 0 <10 <10 28 C <10 <10 3 0 <10 <10 29 19 3<10 <10 4 21 <10 <10 30 1<10 <10 <10 5 27 <10 <10 31 <10 36 <10 6 0 <10 <10 32 <10 <10 <10 7 35 12 <10 33 <10 <10 <10 8 0 <10 <10 34 5 <10 <10 9 23 <10 <10 35 <10 <10 <10 10 15 <10 <10 36 <10 <10 <10 11 50 15 <10 37 <10 <10 <10 12 0 17 <10 38 13 8 13 <10 39 <10 <10 <10 14 0 <10 <10 >( 40 <10 <10 <10 15 8 14 <10 41 <10 <10 <10 16 0 <10 <10 42 <10 <10 <10 17 18 8 <10 43 14 <10 <10 18 54 35 <10 44 <10 <10 <10 19 45 <10 <10 <10 20 46 <10 <10 <10 21 14 <10 <10 47 <10 <10 <10 22 13 <10 <10 48 16 <10 <10 23 21 <10 <10 49 14 <10 <10 24 0 <10 <10 50 <10 <10 <10 25 5 4 <10 51 <10 <10 <10 26 65 <10 <10 在本项目的研究中，我们先建立了等度洗脱高效液相色谱法，并用此方法分析了一批临床样品。由于等度洗脱法6-MMP不能很好出峰，我们继续对方法进行改进，采用梯度洗脱程序，在优化的实验条件下，在16 min 内6-TG、6-MP、6-TX和6-MMP得到良好的分离，并用向正常健康人血样中加标的方法进行了精密度和准确度实验，结果良好。由于 ALL 患者血样不易得到，所以还没有用梯度洗脱HPLC 法分析ALL 患者 红血球中 6-MP 及其代谢物的结果。 3讨论 由于硫嘌呤类药物治疗 ALL 等疾病的效果和毒副作用在患者个体之间的差异很大，所以，在治疗的过程中监测病人体内硫嘌呤类药物的活性代谢学产物(如6-TGNs)和非活性代谢产物(如6-MMP)，并以次为依据调整治疗和用药方案，进行个体化治疗，对提高药物疗效、减小毒副作用具有非常主要的意义。 Lennard 和 Singleton2.3]建立了同时测定红细胞中6-TGNs 和6-MMPNs 的 HPLC方法，其样品处理方法是将红细胞样品在1.0 mol/L 的 H2SO4介质中于100℃下水解1h，使6-TGNs 和6-MMPNs水解为相应的母体硫嘌呤6-TG和6-MMP，然后在碱性介质中用含乙酸苯汞的甲苯溶液将6-TG和6-MMP萃取到有机相甲苯中，再用 0.1 mol/L的 HC1将6-TG和6-MMP反萃到水相中，用于高效液相色谱分析。在样品水解的过程中加入 DTT 以防止含硫基团被氧化。PMA 萃取的效率与萃取时的pH值密切相关，碱性越强，萃取效率越高1101。 Dervieux 和 Boulieu 4，5]的样品处理方法是在红血球中加入固体 DTT， 然后用 HCl04沉淀蛋白，离心，提取液于100℃下水解45 min， 将硫嘌呤核苷水解转化为相应的硫嘌呤，水解液直接用于 HPLC 分析。 Dervieux 和 Boulieu 的研究结果表明，6-MMPNs 在酸水解的过程中会转化为4-氨基-5-(甲硫基)羰基咪唑衍生物，转化效率与水解时的pH密切相关，在硫嘌呤核苷水解转化为硫嘌呤的条件下，6-MMPNs的转化率为100%。因而在色谱分析时色谱图上没有6-MMP的色色峰，而有6-MMP衍生物的色谱峰。他们认为本方法不能直接测定6-MMP，但可以通过其衍生物间接测定。但 Hawatari 等【6，7稍作修饰的 Dervieux 和 Boulieu 方法却在色谱图中得到了6-MMP的色谱峰，他们认为水解时 6-MMP 并不能完全转化，因而可以直接测定红细胞中6-MMP的含量。 Su 等111用100iL血浆，相向中加入25 iL 1 mol/L的 HCl， 旋转混合，置上冷却，在加入25{iL TE缓冲液， 旋转混合，置冰上冷却后离心超滤除去蛋白质，取50 iL注入液相色谱仪分析。分析时用C18反相柱，梯度洗脱，在40分钟内6-MP及其7种代谢产物得到良好分离。这7种代谢物是6-TG、6-TX、6-巯基嘌呤核苷(6-mercaptopurineriboside， rMP)、6-硫鸟嘌呤核苷(6-thioguanosine， rTG)、6-硫黄嘌呤核苷(6一thioxanthine riboside，rTX)、6-MMP和6-甲基巯基呤核苷(6-methylmercaptopurine riboside， rMMP)。这种处理方法由于不用水解，可以同时测定硫嘌呤和硫嘌呤核苷。 Shipkova 等18.9对比研究了 Lennard 和 Singleton 方法与 Dervieux 和 Boulieu 方法。结果表明，用 Dervieux 和 Boulieu 的方法测得的 TGNs 的含量是用 Lennard 和 Singleton 的方法测得的含量的2.6倍，虽然两种方法所得到的结果是显著相关的。如果将 Lennard 和Singleton 方法中水解介质有 H2SO4 改为 HClO4，则两种方法的差异减小到1.4倍。Stefan等也报道了近似的结果9。 文献报道的6-MP 及其代谢产物的分析结果相差很大，各实验室之间的结果可比性很差，数据也无法交流和共享，这主要与样品处理和提取方法有关。因此，分析方法的标准化是今后研究工作的重点110]。 ( 参考文献 ) ( [1 ] Cuffari C， S eidman EG， L a tour S and Theoret Y. 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