杜仲叶中绿原酸检测方案(液相色谱仪)

第27卷增刊2008年5月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.27. Supp1.2008-5 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第27卷增刊2008年5月Vol.27. Suppl.2008-5 微波助提取及 HPLC检测杜仲叶中的绿原酸 童 玲，欧阳湘云，韩玉波，王玉枝?，崔 钥，熊劲芳 (化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学化学化工学院，长沙410082) 摘 要：本文分别用微波辅助提取、超声助提取、冷凝回流提取、室温冷浸提取4种方法提取杜仲叶中的绿原酸，并将4种提取方法进行比较，用反相高效液相色谱法检测其含量。实验采用日本采津C：(15 mm X4.6 mm，5um)色谱柱，V(甲醇)：V(水)：V(冰醋酸)=60：4010.3为流动相，流速为0.8 mL/min，紫外检测波长为332 nm， 进样体积为10L。实验结果表明：绿原酸在4.07 ×10~~2.22 pg范围内线性关系良好，回收率为103.22%(RSD=1.28%)。本法具有良好的精密度、重现性，结果准确可靠，可作为杜仲药材及绿原酸类产品的质量控制方法。 关键词：微波辅助提取；杜仲；绿原酸；高效液相色谱法 微波作为一种高效便捷的提取手段，被广泛应用于中草药的开发生产中1~31。高效液相色谱法可用于药物分析和质量控制4~。杜仲18~11]是湖南省重要的中药资源，其中的主要活性成分是绿原酸。绿原酸12具有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性。绿原酸在国际市场上不菲的价格使得其广泛应用受到制约，为了更好的利用我国的杜仲资源，研究新型、高效、清洁的生产工艺从杜仲中提取绿原酸，并用高效液相色谱法对其进行含量检测具有重要意义。本文采用高压微波辅助提取法提取杜仲叶中的绿原酸，并与超声波助提取法及室温冷浸提取法等进行了对比。研究结果表明：微波作为一种新型、高效、便捷、快速的提取手段，显示出越来越大的优势，将日益应用到中草药大规模开发生产中。 实验部分 1.1 仪器与试剂 LC-10ATvp 高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-10Avp 紫外检测器(日本岛津公司)；UV1100紫外可见分光光度计(北京分析仪器厂)；MDS2002AT压力自控密闭微波消解/萃取系统(上海新仪微波化学科技有限公司)； AS2060B 超声波清洗 器(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)； TCL-16C 高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。绿原酸标准样品由 Alfa Aesar公司提供，用乙醇配制成对照品标准溶液储备液(127.2ug/mL)；甲醇(HPLC级)；实验用水为3次蒸馏水；其他试剂均为分析纯；杜仲叶由湖南省张家界湖南省林产化工工程重点实验室提供。杜仲皮(未烘烤和已烘烤)购于湖南省长沙市高桥药材大市场，产地均为湖南湘西。杜仲平压片(贵州天安药业股份有限公司)。 1.2 实验方法 1.2.1 原料预处理 将杜仲叶剪碎，倒入研钵中磨碎至粉末，保存于干燥器中备用。杜仲皮用同种方法预处理。杜仲平压片首先将其外层糖衣去除，然后放入研钵中磨碎至粉末，保存于干燥器中备用 1.2.2 微波辅助提取法 称取0.5g杜仲叶粉末于萃取内罐中，加入适量活性炭，在实验研究所得的最佳微波提取条件下进行微波提取，提取完全后取出萃取罐冷却至室温，然后打开罐将罐内物质进行离心分离，收集上层清液。将下层残留物在同样条件下再提取、离心一次，用少量提取液清洗萃取罐，合并两次清液一起转移至25mL ( * 基金项目：湖南省自然科学基金项目资助 ) ( 作者简介：王玉枝(1963-)，女，硕士，教授； E-mail： w yzss @tom. com ) 容量瓶中，用60%的乙醇水溶液定容至刻度，摇匀并经0.45 um过滤膜过滤、超声波脱气后待检测。 1.2.3 超声助提取法 称取0.5g杜仲叶粉末于密闭容器中，加入适量活性炭，再与适量60%的乙醇水溶液混合均匀，超声振荡80 min， 将提取液进行离心分离并收集上层清液，移至25 mL 容量瓶中，用60%的乙醇水溶液定容，摇匀并经0.45um过滤膜过滤、超声波脱气后待检测。 1.2.4 冷凝回流提取法 称取0.5g杜仲药材粉末于密闭容器中，加入适量活性炭，再与适量60%的乙醇水溶液混合均匀，冷凝回流6h，然后再用60%的乙醇水转移至离心管中，离心并收集上层清液，移至25mmL容量瓶中，用60%的乙醇水定容，摇匀并经0.45 um 过滤膜过滤、超声波脱气后待检测。 1.2.5 室温冷浸提取法 称取0.5g杜仲叶粉末于密闭容器中，加入适量活性炭，再于适量60%的乙醇水溶液混合均匀，室温浸泡30h，离心分离并收集上层清液，移至25mL 容量瓶中，用60%的乙醇水溶液定容，摇匀并经0.45 um过滤膜过滤、超声波脱气后待检测。 1.3 色谱条件 采用Ci8(岛津15 mm X4.6 mm，5 {m)色谱柱，柱温为25℃，流动相V(甲醇)：V(水)：V(冰乙酸)=60401.3，流速0.8 mL/min，检测波长332 nm，进样体积10uL。采用面积外标法。绿原酸分离良好，分离度大于1.5，峰形对称。 2 结果与讨论 2.1 最大吸收检测波长的确定 取绿原酸对照品溶液，在240~380nm进行光谱扫描，绿原酸的最大吸收波长为332 nm。故选332nm作为检测波长。 2.2 溶剂的选择 在相同的微波提取条件下，比较不同体积分数甲醇、乙醇、丙酮三种提取剂的提取效率，结果表明：乙醇对杜仲中绿原酸的提取效率最高，故实验选定用乙醇作为提取溶剂。 2.3 不同提取方法的比较 对同一批杜仲叶样品，用60%的乙醇水溶液进行了微波助提取、超声助提取、冷凝回流和室温冷浸提取方法的比较，结果见表1。不同提取方法制备的杜仲叶HPLC 色谱图见图1。 表1 室温冷浸、冷凝回流、超声提取、微波提取方法比较 方法 质量 溶剂用量 提取时间 提取率 g /mL t/min (mg/g) 室温冷浸 0.5 25 1800 5.13 冷凝回流 0.5 25 360 7.23 超声提取 0.5 25 80 8.94 微波助萃取 0.5 25 2 21.07 图1 不同提取方法制备的杜仲叶 HPLC指纹图谱 (a)微波提取；(b)超声提取；(c)冷凝回流；(d)室温冷浸 从表1和图3可以得出，对相同量的杜仲叶样品中绿原酸的提取，微波提取效率明显高于超声提取法和传统提取法。说明微波提取法具有提取效率高、提取时间短、节约能源等的优点，本实 验选用微波提取法作为提取方法。 2.4 微波提取时间的选择 在其它微波条件不变，只改变微波提取时间的条件下，制备样品供 HPLC，以2 min为佳。 2.5 微波提取液固比的选择 在相同的微波条件下，不断改变液固比，研究液固比和提取效率的关系。随着溶剂用量的增加，绿原酸提取率不断增加，从25mL/g增加到50mL/g时，绿原酸提取率增加最快，而溶剂用量再继续增加时，提取效率反而降低。本文选用50mL/g作为提取固液比。 2.6 微波提取压力的选择 在其它微波条件固定时，不断改变微波压力。微波压力为2atm时，提取效率最高。 2.7 最佳微波提取条件的确定 实验选择影响杜仲叶中绿原酸提取过程的主要因素-微波压力、辐射时间、固液比及溶剂浓度，根据单因素试验的结果，在各因素的最佳实验条件的基础上，采用L，(3*)正交实验方案，摸索最佳微波提取条件。实验因素水平和结果分别见表2、表3. 因素水平表 编号 AZ醇水比B料液比C提取时间D提取压力 (ml：ml) /(g/mL) t/min (a tm) 1 46 150 1 1 2 55 125 2 2 3 64 1：15 3 3 表3LLg(3*)正交设计表及结果 编号 A B C D 提取率 /(mg/g) 1 1 1 1 1 17.41 2 1 2 2 2 18.69 3 1 3 3 3 13.95 4 2 1 2 3 22.35 5 2 2 3 1 13.73 6 2 3 1 2 15.09 7 3 1 3 2 22.80 8 3 2 1 3 19.80 9 3 3 2 1 14.10 K1 50.05 62.56 52.30 45.24 K2 51.17 52.22 55.14 56.58 K3 56.70 43.14 50.48 56.10 R 6.65 19.42 4.66 11.34 正交实验表明：最优的实验条件是A是BCD2，提取率为26.4%。从表中看出，因素B和D各水平之间有较大差异，因素B和D为本实验主要因素，因素A和C是次要因素。结果表明：在AsBiCD2(即在乙醇浓度60%、固液比150、辐射时间2 min、微波压力2 atm)条件下，绿原酸的提取率最高。 2.8 pH的影响 绿原酸具有邻苯二酚多羟基结构(如图2所示)，常以盐的形式存在于植物中，酸性条件有利于其测定，并且合适的酸度还能改善峰形。经实验摸索我们最后确定在流动相中每100mL甲醇水混合液中加入0.3mL冰乙酸，此时峰形最好。 图2 绿原酸的结构式 2.9 标准曲线和线性关系的考察 准确称取0.0318g绿原酸标准样品，用少量乙醇溶解，然后转移至25 mL 容量瓶中并用乙醇定容，配制成标准储备液127.2 ug/mL。然后依次稀释成梯度分布，每次进样量为10匹，在上述色谱条件下依次进样进行测定。以绿原酸的质量(ug)为横坐标，以峰面积(mAU)为纵坐标，绘制标准曲线。绿原酸质量浓度在4.07 ×104~2.22ug范围内线性关系良好，线性回归方程： Y=1227360.613X+56710.09(r=0.9997)。 2.10 方法学考察 2.10.1 精密度试验 按1.2.2方法微波制样，连续进样5次，结果绿原酸峰面积的RSD=0.625%。表明仪器的精密度良好。 2.10.2 重现性试验 取同批次样品6份，按1.2.2进行微波制样，进样，测定。结果RSD=2.08%，表明本法重现性良好。 2.10.3 稳定性试验 对2.10.1样品，分别在0、2、4、6、8、10、12h进样10uL，RSD=2.57%，表明杜仲提取液稳定性良好。 2.10.4 回收率试验 采用加样回收法，称取同批样品0.2g，精密称定6份，加入60%的乙醇溶液10mL。然后各加入10 mL (127.2 ug/mL)的绿原 酸标准溶液，在同样的微波条件下，微波时间依次为1、2、3、4、5、6 min制备样品，进样10uL。然后在相同条件下，不加入标准溶液，进行样品制备，并进样分析，进样10uL。表4列出了1mL待测样品中绿原酸的质量。 表4 样品添加回收率实验 样品 初始量 添加量 测得总量 回收率 RSD/% /mg /mg /mg /% (n=6) 1.704 1.272 3.015 101.31 1.28 2 2.254 1.272 3.649 103.49 3 2.017 1.272 3.394 103.19 4 1.919 1.272 3.268 102.41 5 1.956 1.272 3.387 104.92 6 1.864 1.272 3.262 104.02 2.11 样品分析 取杜仲叶、未烘烤(自然晾干)的杜仲皮、已烘烤的杜仲皮适量磨成粉末；杜仲平压片去除外层糖衣磨成粉末。然后按1.2.2实验方法进行实验，其色谱图见图3，实验结果见表5。 图3 绿原酸标样及杜仲样品的色谱图 (a)绿原酸标样；(b)杜仲叶；(c)未烘杜仲皮；(d)已烘杜仲皮粉；(e)杜仲平压片 表5 杜仲各样品的含量测定结果 样品 质量 料液比 提取率 RSD/% /g /(g/mL) /(mg/g) (n=6) 杜仲叶 0.2 150 21.53 1.94 未烘杜仲皮 0.2 150 2.78 2.77 已烘杜仲皮 0.2 150 2.26 2.43 杜仲平压片 0.2 150 8.38 3.22 ( 参考文献 ) ( 1 ] 戚向阳.中草 药 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