鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ 、丹参酮ⅡA检测方案(液相色谱仪)

分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第27卷增刊2008年5月Vol.27.Suppl.2008-5 RP-HPLC 测定不同月份康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IA的含量 岳会兰”，赵晓辉2，邵 云*1，陶燕 (1.中国科学院西北高原生物研究所，西宁810008；2.中国科学院研究生院，北京100039) 摘 要：建立一种RP-HPLC方法，用于测定康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IA的含量，为康定鼠尾草开发利用提供依据。采用 Thermo C8色谱柱，以V(甲醇)：V(水)=7525为流动相，流速1mL/min，检测波长270mm，柱温30℃。结果表明3个化合物在测定的范围内具有良好的线性(r>0.9997)，平均回收率为98.6%。康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IA的含量八月份较高。方法可作为康定鼠尾草中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IA的含量测定的方法。 关键词：康定鼠尾草；隐丹参酮；丹参酮I；丹参酮 IA； RP-HPLC 康定鼠尾草(Salvia prattii) 唇形科鼠尾草属植物，分布于青海杂多、囊谦、玉树、称多、久治等地的山坡草地、岩石缝、半阴坡地、河滩、林下。唇形科鼠尾草属植物，全世界约1000多种。我国有83种，25变种，9变型，其中药用30余种，大多数以根入药作丹参用。丹参是该属植物的代表药材，为临床常用中药，具有活血祛瘀，调经止痛，清热安神等功效”，鉴于此，从该属植物中找丹参代用品的研究非常活跃。甘肃产甘西鼠尾草及其变种褐毛甘西鼠尾草在甘肃、北京等地已作为丹参的代用品使用[4.5]。薛明等人从甘西鼠尾草中分离得到了隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA等二萜醌类化合物6。目前未见到康定鼠尾草的相关报道，因此我们对不同月份康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮同I、丹参酮IA的含量做了分析，以期为康定鼠尾草的开发利用提供依依。本试验在借鉴文献方法的基础上，经过反复试验，建立了适合康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮IA的 RP-HPLC同时测定方法，经方法学考察，该方法能使康定鼠尾草根的化学成分得到良好分离。 实验部分 1.1 仪器、试剂与药材 大连江申L10-P高效液相泵， Waters2487 检测器，大连江申JS-3050 色谱工作站，PH230柱温箱，分析天平。0.45 um微孔滤膜(Waters 公司)。 甲醇为色谱纯，水为超纯水。隐丹参酮(批号：852-9903)、丹参酮 I、丹参酮ⅡA(批号：110766-200417)对照品购自中国药品生物制品检定所。 康定鼠尾草根分别于2007年5月、6月、7月、8月采自青每久治，经中国科学院西北高原生物研究所藏药中心梅丽娟高级工程师鉴定为鼠尾草属康定鼠尾草(Salvia prattii)。 1.2 方法 1.2.1 色谱条件 Ci反相色谱柱(Thermo C8柱(ODS， 250 mm ×4.6 mm))，柱温：30O℃；UV检测波长：270nm；灵敏度：1.0AUFS；流动相：V(甲醇)：V(水)=7525；流速：1.0mL/min。 在该色谱条件下隐丹参酮、丹参酮 I、丹参酮IA的保留时间分别为13.465，14.715，21.897min，对照品混标的高效液相色谱图见图1。 ( * 基金项目：中国科学院知识创新工程项目(CXLY2002-9) ) ( 作者简介：岳会兰(1981-)，女，硕士研究生 ) 图1 对照品混标的高效液相色谱图 1-隐丹参酮；2-丹参酮I；3-丹参酮IA 1.2.2 样品溶液的制备 精密称取五月份，六月份，七章份，八月份样品粗粉(过100目筛)各0.5g，置250 mL 锥形瓶中，精密加入甲醇40mL，超声波振荡提取1h，冷却至室摄，用甲醇定容到50mL的容量瓶中，再经0.45 um微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。 1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IA对照品适量，加甲醇溶解，准确定容，配制成质量浓度分别为4.25，1.75，0.089 ug/mL 的混合对照品溶液，用0.45 um微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液。 1.2.4 线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液6，8，10，12，14uL进样，测定隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ的峰面积积分值，以峰面积积分值y为纵坐标，进样量(ug)为横坐标进行线性回归，得回归方程：隐丹参酮 Y=34482918X+5879.8，r=0.9998，线性范围0.0255~0.0595ug；丹参酮IY=12191143X+1200，r=0.9997，线性 范围0.0105~0.0245ug； 丹参酮 A Y=324525281X-999.9，r=0.9997，线性范围0.0005~0.0012ug. 1.2.5 精密度考察 取对照品溶液，连续进样5次，每次10uL，测定隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA的峰面积的RSD分别为1.7%，1.9%，1.6%(n=5)。 1.2.6 稳定性考察 取八月份的样品溶液，于0.2，4，8，16，32h分别进样10匹L，测定，计算隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IA峰面积的RSD分别为2.0%，2.5%，2.9%(n=6)。表明供试品溶液在32h内稳定。 1.2.7 重复性试验 精密称取八月份的鼠尾草根粉末5份，约0.5g，照供试品溶液制备方法制备供试液并测定，结果隐丹参酮、丹参酮iJI、丹参酮IA的峰面积的RSD分别为1.7%，1.8%，2.3%(n=5)。 1.2.8 回收率考察 精密称取已测知含量的鼠尾草根粉末约0.5g，5份，分别加入标准品混合液1mL(隐丹参酮4.25ug，丹参酮Ⅰ1.75ug，丹参酮IA 0.089 ug)，照供试品溶液制备方法制备供试液，在上述色谱条件下分别进样10uL，隐丹参酮、丹参酮 I、丹参酮ⅡA 的平均回收率分别为99.8%，98.9%，97.2%，RSD 分别为2.3%.2.6%，2.1%。 1.2.9 样品测定 在2.1项色谱条件下，分别精密吸取4个月份的供试品溶液各10uL进样分析，测定峰面积，根据回归方程计算各样品中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA的含量，结果见表1.不同月份的高效液相色谱图，见图2. 表1 不同月份康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量 样品 指标含量/%(n=5) 隐丹参酮 丹参酮I 丹参酮IA 五月份样品 0.436(2.1%) 0.142 (1.8%) 0.009(2.3%) 六月份样品 0.402(2.6%) 0.151(3.1%) 0.010(1.9%) 七月份样品 0.459(1.8%) 0.189(2.0%) 0.010(2.2%) 八月份样品 0.463(1.7%) 0.185(1.8%) 0.012(2.3%) 注：括号内数值为RSD% 图2 不同月份康定鼠尾草根的高效液相色谱图 (a)五月份；(b)六月份；(c)七月份；(d)八月份 1-隐丹参酮；2-丹参酮I；3-丹参酮IA 2 讨论 (1)考察了冷浸法、回流法、超声法3种提取方法对隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA含量测定的影响。结果表明，3种提取法的提取效率相近，因超声提取操作简便、快速，故选择超声法提取。 (2)检测波长的选择：文献报道，丹参酮IA最大吸收为254 nm，隐丹参酮在281nm附近有吸收。经试验证明，以270 nm 为检测波长，隐丹参酮、丹参酮II、丹参酮IA均可被检出，且分离较好， (3)含量定定结果表明，八月份康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮IA的含量明显高于五、六、七月份康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮A的含量。但相对于丹参药材，康定鼠尾草中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮IA的含量不高。而同生长在青藏高原上的绒毛鼠尾草 和甘西鼠尾草，其丹参酒IA、隐丹参酮的含量却高于丹参药材中丹参酮IA、隐丹参酮的含量。对于康定鼠尾草能否具有更好的药用价值，还有待于进一步的研究。 ( 参考文献 ) ( [1] 中国科学院西北高原生物研究所编.青海植物志(第 3卷).青海人民出版社，1996 ) ( 2 中国科学院北京植物研究所主编.中国高等植物图 鉴(第三册).科学出版社，1974 ) ( ][3 3 ] 1 徐任生.丹参及其生物学应用.北京：科学出版社， 1987.5 ) ( [4 连文琰，童玉懿，冯瑞芝.中草药通讯，1978，(8)： 41 ) ( 5] 徐国钧等.生药学.北京：人民卫生出版社，1987. 340 ) ( 6 薛 明，史彦斌，崔 颖等.天然产物研究与开发， 1999，12(6)：27 ) —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net