槲皮素、绿原酸和异槲皮甙中主要成分含量检测方案(毛细管电泳仪)

分析化学(FENXIHUAXUE) 研究简报Chinese Joumnal of A nalytical Chem istry第12期1741~1744第34卷2006年12月 第34卷分析化学1742 离子液体修饰毛细管胶束电动色谱法分离测定檞皮素、绿原酸和异檞皮甙 王月伶 胡中波 袁倬斌 (中国科学院研究生院化学与化学工程学院，北京100049) 摘 要 建立了一种离子液体(1乙基-3甲基咪唑四氟硼酸盐，1E-3MFTFB)修饰毛细管胶束电动色谱法分离测定异皮甙、绿原酸和和皮素的方法。研究了缓冲溶液的酸度和浓度、牛磺胆酸纳的浓度以及 1E-3MI-TFB 对分离的影响。分离的最佳条件为：25mmol/L硼砂磷酸二氢钾(pH9. 0)-40 mmol/L牛磺胆酸钠-1%(V/V)1E-3MF-TFB，电压16kV。在优化条件下，3种分析物在11min内可以得到良好的分离。异皮甙、绿原酸和和皮素的峰面积和浓度分别在0.02~0.40、0.02~0.20和0.08~0.60g/L浓度范围内呈良好的线性；线性相关系数分别为0.99980.9988和0.9991；3种物质基于峰面积的相对标准偏差分别为：248%，2.56%和3.03%；基于迁移时间的相对标准偏差分别为1.12%、1.46%和 1.59%；检出限(S/N=3)分别为：异皮甙，0.0050 g/L；绿原酸，0.0045 g/L；桶皮素，0.0040 g/L。将此方法应用于分离测定欧亚旋覆花中的异皮甙、绿原酸和檞皮素，取得良好结果。 关键词 毛细管胶束电动色谱，离子液体，1乙基-3甲基咪唑四氟硼酸盐，欧亚旋覆花 1 引 言 离子液体又称室温离子液体或室温熔融盐。离子液体在室温及临近温度下完全由离子组成。典型的离子液体由含氮的有机阳离子和无机阴离子构成。离子液体通常具有如下特点：较低的蒸气压，较宽的电化学窗口，良好的导电性和热稳定性，液体状态温度范围广，对许多有机物、无机物都具有良好的溶解性。离子液体因其独特的特性在催化【2、有机合成3、电化学41等领域得到了广泛的应用。Vaher将离子液体用于非水毛细管电泳中分离了不溶于水的染料。此外还将离子液体作为非水毛细管电泳的添加剂分离了一部分路易氏酸和多酚类化合物16]。 Yanes等用阳离子部分是1烷基-3甲基咪唑的离子液体作为电解质分离了葡萄籽提取物中的多酚类化合物，认为分离的机理是离子液体在毛细管表面形成了带电的薄层，离子液体的阳离子部分与分析物之间存在相互作用而分离。Jiang等将阳离子部分是1烷基-3甲基咪唑的离子液体用于毛细管电泳分离中，分离了溶菌菌、细胞色素、胰蛋白酶等碱性蛋白质，具有良好的重现性和分离效率。Wamer等用离子液体和多聚的表面活性剂作为胶束电动色谱的修饰剂分离了一些手性和非手性的化合物。Qin等10将1，3二烷基咪唑离子液体涂覆在硅胶上做成毛细管柱成功分离了 K*、Na Li、ca Mg 和 Ba*，并能检测出人尿中的微量((约0.37%)的NH；此外，Q in等用离子液体涂层毛细管内壁使电渗流反向，测定了碱金属、碱土金属、镍、铅和氨离子。Qi等用1丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐作为背景电解质，β环糊精作为修饰剂测定了中药中的蒽醌类化合物。肖小华等对离子液体在分离分析中的应用进展进行了综述。 研究表明，槲皮素具有止咳、去痰、平喘和降血压的作用，绿原酸具有抗炎、抗病毒等药理作用。本研究建立了一种离子液体1乙基-3甲基咪唑四氟硼酸盐修饰毛细管胶束电动色谱法分离测定皮素、绿原酸和异槲皮甙的方法，并对欧亚旋覆花中的皮素、绿原酸和异桶皮甙进行了分离测定。 2 实验部分 2.1 仪器和试剂 ACS2000高效毛细管电泳仪(北京科陆科学仪器有限公司，中国科学院研究生院应用化学研究 ( 2006-01-15收稿；2006-06-01接受 ) ( 本文系国家自然科学基金资助项目 (No 20175025，29875027，20235010) ) 所)，检测波长254 nm， 未涂层弹性石英毛细管柱 60 cmX50um，有效长度51cm(河北永年光导纤维厂)；分离电压 16 kV，静压力进样(高度10cm，时间6s)；背景电解质为25mmol/L硼砂磷酸二氢钾(pH9.0)-40 mmol/L牛磺胆酸钠-1%0(V/V)1E-3M I-TFB，使用前超声脱气 10min； PHS-3B型酸度计(上海雷磁仪器厂)；H66005型超声清洗机(无锡电子设备厂)。毛细管使用前用 0.10 mol/L NaOH水和工作缓冲溶液各清洗 10、5、5 min， 每次电泳后分别用0.10 mol/L NaOH、水和工作缓冲溶液清洗4、3、3 m in， 以保持迁移时间和峰面积良好的重现性。檞皮素(Sigma公司)；绿原酸(Fluka公司)；异檞皮甙(Sigma公司)；1乙基-3甲基咪唑四氟硼酸盐(1E-3MFTFB)(Fluka公司)，牛磺胆酸钠(中国药品生物制品检定所)。其它试剂均为分析纯，水为二次石英蒸馏水。 2.2 样品处理 将欧亚旋覆花在烘箱中 60℃干燥6h，然后粉碎，过0.075mm 孔径筛。准确称取一定量粉末，加入100 mL甲醇索氏提取6h。提取液冷却后过滤，滤液真空浓缩至大约20mL，在 50mL容量瓶中用甲醇稀释至刻度，待测。 3 结果与讨论 3.1 缓冲溶液 pH和浓度的影响 在 pH 7.5~10.0范围内研究了缓冲溶液 pH对分离的影响，如图1a所示。当pH9.0时3种分析物可以很好的分离，标准物质的电泳图如图2a所示。当pH高于9.0时，绿原酸的峰形不好，檞皮素的峰高有所降低，pH低于9.0时，绿原酸和檞皮素的分离度差，因此选择9.0作为最佳 pH。缓冲溶液浓度对分离的影响如图1b所示，随着缓冲溶液浓度的增加3种分析物的迁移时间和分辨率均增加，但缓冲溶液的浓度过高会造成较多的焦耳热，影响检出限和分离效率。因此，选择25 mmol/L作为最佳缓冲溶液浓度。 图i 缓冲溶液酸度(a)和浓度(b)对分析物迁移时间的影响 Fig 1 Effects of buffer acidity (a) and buffer concentration (b) on migration time of analytes1.异檞皮甙(isoquercitrin)；2.绿原酸(chlorogenic acid； 3.檞皮素(quercetin)。 3.2 牛磺胆酸钠的影响 在20~60 mmol/L范围内研究了牛磺胆酸钠的影响。随着浓度的增加，迁移时间增加，绿原酸和和皮素的分离度改善，但对异檞皮甙和绿原酸的分离度无明显影响。综合考虑分离度和分析时间，选择40 mmol/L的牛磺胆酸钠，电泳图如图2b所示。 3.3 离子液体1E-3M FTFB的影响 当1%0(V/V)1E-3M FTFB加入到缓冲溶液中时，结果如图2c所示。不仅改善了斛皮素的峰形，而且明显的改善了绿原酸与异檞皮甙的分离度，使绿原酸、异皮甙和皮素都能得到很好的分离。当1E-3M ITFB的浓度高于1%0(V/V)时，不仅檞皮素和绿原酸的峰形变差、两者的分离度降低，而且分析时间也明显延长。实验选择1%0 1E-3M ITFB (V/V)。 3.4 线性范围、重现性和检出限 在优化条件下，3种物质在11min内实现了良好的分离，标准物质电泳图如图2c所示。对分析物的线性进行行究，以峰面积对浓度作图，异图皮甙、绿原酸和皮素分别在0.02~0.40、0.02~0.20和 图2标准(a， b， c)及样品(d)电泳图谱 Fig 2 Electropherogram s of standard mixture(a， b， c) and samp le(d) 电泳条件 (conditions)： a 25 mmol/L Borax-KH， PO4， pH 9. 0)； b 25 mmol/L Borax-KH， PO4-40 mmol/L牛磺黄酸钠 (sodium tauiocholate， STC；c， d 25 mmol/L Borax-KH， PO4-40 mmol/L STC 1% 1-ethyl-3methylim idazo liumtetrafluomborate (1E-3MFTFB)，V/V。1.异皮甙 (isoquercitrin)；2.绿原酸(chlorogenic acid； 3.皮素(querce-tin)。 0.08~0.60g/L浓度范围内呈良好的线性，线性相关系数分别为：0.9998、0.9988和0.9991。通过5次连续注射含有3种物质的标准溶液计算了重现性，异皮甙、绿原酸和檞皮素峰面积的相对标准偏差分别为2.48%、2.56%和3.03%；迁移时间的相对标准偏差分别为1.12%、1.46%和1.59%。3种物质的检出限(S/N=3)分别为：异皮甙0.0050 g/L、绿原酸 0.0045 g/L皮素 0.0040 g/L。 3. 5 样品分析 利用所建立的方法分析了欧亚旋覆花甲醇提取液中的异异皮甙、绿原酸和和皮素，样品电泳图图图2d所示。根据迁移时间和标准加入法定性。向样品中准确加入一定量的异皮甙、绿原酸和桶皮素，做加入回收实验，回收实验结果见表1。样品的测定结果见表 2. 表1 回收率实验结果(n=3) 表2欧亚旋覆花样品分析结果(n=5) Table 1 Results of recoveries (n=3) Table 2 Analysis re sults of Inu labrilam ica L.(n=5) 成分 含量 加入量 测出量 回收率 RSD Content Added Found Recovery (%) Component (mg) (mg) (mg) (%) 槲皮素 Quercetin 5.504 4.0 9. 596 102.3 2.4 绿原酸 Chlorogenic acid 3.381 4.0 7.325 98.6 1.9 异槲皮甙 Isoquercitrin 2.098 3.0 5. 020 97.4 2.1 3. 6 结论 实验表明，单独采用牛磺胆酸钠胶束体系分离皮素、绿原酸和异檞皮甙时，绿原酸和桶皮素的分离度可以明显改善，但对改善异皮甙与绿原酸的分离度无明显影响，且檞皮素的峰形变差。加入1%1E-3M FTFB (V/V)后，不仅使3种分析物能够很好的分离，而且也改善了槲皮素的峰形。 ( References ) ( Sionoja M . 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C hromatogr A， 2004， 1059：191~198 ) 13 iXiaoXiaohua(肖小华)， Liu Shujuan(刘淑娟)，Liu Xia(刘霞)， Jiang Shengxiang (蒋生祥). Chinese J. Anal Chen.(分析化学)，2005，33(4)：569~574 Separation and Determ ination of Quercetin， Chlorogen ic Acidand Isoquercitr in by Ion ic L iqu id M od ified M icellarElectrokinetic Capillary Chroma tography Wang Yueling， Hu Zhongbo， Yuan Zhuobin (College of Chen istry and Chen ical Engineering， Graduate School of Chinese A caden y of Sciences， B eijing 100049) Abstract An ionic liquid (1-ethyl-3methylim idazolium tetrafluoroborate，1E-3M ITFB) modified micellarelectrokinetic cap illary chromatographic (MEKC) method was developed to separate and detemine isoquercitrin， chlorogenic acid and quercetinThe effects of buffer pH and concentration，sodium taurocholate(STC) concentration and ionic liquid on separation were investigatedThe optimum electrophoretic conditionswere as follows： 25 mmo1/L borax-KH，PO4(pH 9. 0)-40 mmol/L STC-1%01E-3M ITFB (V/V) as the run-ning buffer，applied voltage of 16 kV. Under the op tim ized conditions， the three analytes were well separatedless than 11 min A good linearity betweenthe peak area and the concentration was observed in the range of0.02-0.40 g/L， 0. 02-0.20 g/L and 0. 08-0. 60 g/L with correlation coefficients of0. 9998， 0. 9988 and0. 9991 for isoquercitrin， chlorogenic acid and quercetin， respectively The relative standard deviation in peakarea and migration time was 2. 5% and 1. 1% for isoquercitrin， 2. 6% and 1. 5% for chlorogenic acid， 3. 0%and 1. 6% for quercetin The detection lm its (S/N =3) were 0. 0050 g/L for isoquercitrin， 0. 0045 g/L forchlorogenic acid and 0. 0040 g/L for quercetint The method was successfully applied to separate and determine isoquercitrin， chlorogenic acid and quercetin in Inu la britam ica L. Keywords Micellar electrokinetic cap illary chromatography， iionicliquid， 1-ethyl-3methylim idazo liumtetrafluoroborate， Inula britam ica L. ( (Received 15 January 2006； a c cep ted 1 June 2 006) ) 《分析化学中的小波分析技术》 卢小泉刘宏德编著 小波变换的概念是由法国从事石油信号处理的工程师J.Morlet在1974年首先提出的并建立了反演公式。它解决了 Fourier变换不能解决的许多困难问题，所以被誉为数学显微镜”，具有分析发展史上里程碑式的意义。本书是分析科学现代方法丛书中的一册，是国内第一本介绍小波分析在分析化学中应用的图书。作者卢小泉教授自1994年始从事小波分析在分析化学中的应用研究，他在自己科研的基础上参阅了国内外大量的有关小波分析的文献后编著此书，书中内容具有很强的针对性和实用性。该书的出版能给分析化学工作者，特别是化学计量学工作者提供一些有价值的参考。定价：25.00元。 ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved http：//www.cnki.net