黄连浸膏粉中生物碱含量检测方案(近红外光谱仪)

分析化学(FENXI HUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第4期477~480第32卷2004年4月 分析化学第32卷478 近红外漫反射光谱法测定黄连膏粉中生物碱含量 瞿海斌 刘 全程翼宇* (浙江大学药物信息学研究所，杭州310027) 摘 要 采用近红外漫反射光谱法对黄连浸膏粉中小檗碱、巴马亭、药根碱和总生物碱含量进行快速无损检测。以 HPLC分析值作参比，采用偏最小二乘回归算法建立二阶导数光谱信息与各组分含量间的定量校正模型，并对未知样品中各组分含量进行预测。小檗碱、巴马亭、药根碱和总生物碱的预测均方差(RMSEP)分别为0.184、0.109、0.054和0.325；加样回收率分别为97.67%~99.59%、96.63%~100.70%、95.15%~101.15%和97.41%~99.89%，重现性实验相对标准准差(RSD)分别为 0.3%、0.6%、1.8%和0.3%。该方法结果准确可靠，重现性、稳定性均良好，适用于工业现场的原位和在线检测 关键词 近红外漫反射光谱，黄连浸膏粉，偏最小二乘回归，在线检测 引 言 黄连浸膏粉是名贵中药黄连的提取物，其主要有效成分为小檗碱、巴马亭、药根碱等生物碱，具有抗菌、消炎和止泻作用，被广泛用于各种中药制剂。生物碱含量测定的常规方法有高效液相色谱法、毛毛管电泳法、薄层层析法和分光光度法等，这些方法都需要经过复杂的样品制备和预处理工作，分析时间长，不能用于工业现场的原位快速分析。近红外(near infrared，NIR)光谱分析是近年来迅速发展和推广应用的一种绿色分析技术[2]，适合于复杂天然产物的定性和定量分析L3，4]。与传统充化学分析技术相比，NIR光谱分析无需制样，在建立可靠的校正模型的基础上，可直接对包装材料中的样品进行无损检测，具有快速、无污染、低成本和多组分同时测定等优点，非常适合于工业现场的在线检测和原位分析。 本实验以黄连浸膏粉为对象，以 HPLC 作为参比方法，建立了对其中主要生物碱含量进行快速无损测定的 NIR 光谱分析法。该方法的分析结果准确可靠，重现性、稳定性和加样回收率均良好，可望发展为一种植物提取物有效组分含量的快速测定方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Antaris 傅里叶变换 NIR 光谱仪(美国 Thermo Nicolet 公司)； Agilent1100 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司)，G1315B型 DAD 检测器，G1313A自动进样器， G1316A 柱温箱，Elite Hypersil ODS 柱(4.6mm×250 mm，5 um，i.d.，大连依利特分析仪器公司)。 黄连浸膏粉由本实验室自制，分别取自35个不同批次。盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、盐酸药根碱对照品购于中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯(Merck 公司)，去离子蒸馏水，其余试剂均为分析纯。 2.2 生物碱含量的 HPLC分析 按文献[5]方法测定黄连浸膏粉样品中小檗碱、巴马亭和药根碱的含量，以这3种生物碱含量总和近似表示总生物碱含量。从35个样品中按含量大小均匀选取8个样品组成预测集，其余27个组成校正集。 2.3 样品的 NIR 光谱采集 黄连浸膏粉粉品研细后过 0.154 mm 筛，装入样品杯中，利用积分球漫反射采样系统采集其 NIR光谱。光谱采集条件：以仪器内置背景为参比，波数范围10000~4000 cml，扫描次数32次，分辨率4cm。每个样品品3次平行实验，取其平均光谱。样品的原始 NIR 光谱图如图1。 ( 2003-0 4 -18收稿；2003-11-17接受 ) ( 本文系国家重点基础研究发展规划项目(No. G1999054408)及浙江省科技厅重大科技计划项目(No.021103549)资助 ) 3 结果与讨论 3.1 数据处理方法 光谱数据经多元散射校正技术(multiplicative scatter correction，MSC)处理和 Norris 导数平滑滤波后，采用偏最小二乘(partial least square，PLS)回归法建立定量校正模型，以校正集样品的交叉验证均方差(RMSECV)及其相对偏差(RSECV)为指标优化建模参数，模型对未知样品的预测效果用预测误差均方根(RMSEP)、相对偏差(RSEP)及相关系数(R)来考核。RMSECV、RSECV、RMSEP、RSEP和 R的计算方法见文献[6]。 3.2 光谱预处理方法的选择 表1为分别采用原始光谱、一阶导数光谱和二阶导数光谱进行建模时的RMSECV 值。从表1可知，采用二阶导数光谱建模时 RMSECV 值最小。从图2二阶导数光谱图也可以看出，光谱数据经二阶导数处理，可消除基线偏移，扣除本底吸收，从而更为细致地反映样品的光谱特征。 v/cm" 图1 样品的原始 NIR 漫反射光谱 图2 二阶导数光谱和建模谱区的选择 Fig.1 Original near infrared (NIR) diffuse reflectancespectra Fig.22 22nd derivative spectrs and the spectra ranges forbuilding model 表11不同光谱预处理方法对 PLS校正模型的 RMSECV 影响 Table 1 Influence of different preprocessing methods on root mean square error of cross-validation (RMSECV) of partialleast square (PLS) models 光谱预处理方法 小檗碱 巴马亭 药根碱 总生物碱 Preprocessing method Berberine Palmatine Jatrorrhizine Total alkaloid 原始吸光度 Absorbance 0.338 0.232 0.118 0.573 一阶导数 First derivative 0.492 0.130 0.082 0.505 二阶导数 Second derivative 0.324 0.097 0.066 0.402 3.3 光谱范围选择 表2为采用3个不同光谱波段的光谱数据建立的校正模型的 RMSECV 值。其中序号1为全波段，序号2为吸收较明显的3个波段，序号3为从序号2中排除掉两个水分子强吸收带后的波段。 表2光谱波段选取对 PLS 模型 RMSECV的影响 Table 2 Influence of NIR spectra wavelength ranges on RMSECV of PLS models 序号 光谱范围(cm-1) 小檗碱 巴马亭 药根碱 总生物碱 No. Wavenumber Range Berberine Palmatine Jatrorrhizine Total alkaloid 1 9999.1~3999.6 0.373 0.134 0.077 0.488 2 9028.6~8075.7，7678.7~7027.3，6275.9~3999.6 0.350 0.121 0.072 0.435 3 9028.6~8075.7，6275.9~5301.4，4900.2~3999.6 0.324 0.097 0.066 0.402 水分子中的—OH 基团在 NIR 光谱区的6993 cm (1430 nm)和 5128 cm (1950 nm)附近分别有一个很强的倍频和合频吸收带项7。从图2二阶导数光谱图中也可以看出，在这两个波数附近各有一个明显的吸收峰，当将这两个波段从建模波段排除后，RMSECV 均显著减小。由此也可以说明，实验中所使用的黄连浸膏粉样品中水份含量较高，可采用 NIR 光谱法可对其进行测定。图2中虚线圈所在的 谱区即为经交叉验证优选得到的最佳光谱范围。 3.4]PLS主因子数的选择和交叉验证结果 采用 PLS法建立定量校正模型时，为避免出现“过拟合”现象，需要对主因子数进行合理选择。本文采用留一交叉验证法，考察了主因子数对 RMSECV 的影响。PLS主因子数优化选择结果和校正集样品交叉验证结果如表3. 表3 最佳主因子阶数和交叉验证结果 Table3Optimal PLS components and results obtained by cross-validation 小檗碱 巴马亭 药根碱 总生物碱 Berberine Palmatine Jatrorrhizine Total alkaloid PLS 因子 PLS components 8 9 9 9 交叉验证均方差 RMSECV 0.324 0.097 0.066 0.402 交叉验证相对偏差 RSECV(%) 1.25 1.42 2.04 1.12 R 0.983 0.987 0.973 0.988 RSECV：relative standard error of cross-validation 3.5 样品分析 将建立的定量校正模型用于对预测集中的8个未知黄连浸膏粉样品中的生物碱浓度进行预测，结果示于图3。从图中可以看出，各生物碱含量的 NIR 光谱预测值均能够准确地逼近 HPLC 测定值。 图3 校正集和预测集样品 NIR 预测值和 HPLC测定值相关图 Fig.3 Correlation between NIR predicted and high performance liquid chromato-graphic measured values (o)校正集(calibration set)；(▲)预测集(validation set)。 3.6 加样回收率实验 取预测集中一份已测含量的黄连浸膏粉样品作为供试品，另从校正集中取一份已知含量的样品作为标准品。称取供试品0.732g，加入标准品0.714g，充分混匀，按前述方法采集光谱，并利用所建立的定量校正模型预测各生物碱含量。平行做5次实验，分别计算加样回收率，结果如表4。 3.7 重现性实验 取某批次样品20份，按前述方法分别扫描描 NIR 光谱，并计算其平均光谱及其相对标准偏差(RSD)光谱。其中，RSD 光谱反应了各次测量的光谱信息在各个波数点处的相对标准偏差。结果显 示，20次测定的光谱在波数为7644.4 cm处偏差最大，RSD 为 2.26%。由此计得得到小檗碱、巴马汀、药根碱和总生物碱含量的 RSD分别为 0.32%、0.63%、1.76%和0.33%，可见重现性良好。 表4力加样回收率实验结果 Table 4 Results of recovery test 成分 加样回收率(%) 平均值(%) 相对标准偏差(%) Component Recovery Average RSD 小檗碱 Berberine 97.83 99.44 97.67 99.59 98.13 98.53 0.93 巴马亭 Palmatine 96.63 101.57 96.92 100.70 96.63 98.49 2.47 药根碱 Jatrorrhizine 95.15 100.55 97.55 101.15 98.15 98.51 2.46 总生物碱 Total alkaloid 97.41 99.95 97.57 99.89 97.79 98.52 1.30 3.8 稳定性实验 取一份待测样品在15天内每天采集其 NIR 光谱，并计算其平均光谱和 RSD 光谱，以考察分析方法的稳定性。结果显示，在15天内采集到的光谱在波数为4900.2 cm-处相对标准偏差最大，RSD 为2.38%。利用前述定量校正模型计算得到的小檗碱、巴马汀、药根碱和根生物碱的 RSD 分别为 0.53%、0.74%、1.64%和0.55%。由此表明，该方法具有较好亢抗环境因素干扰的能力。 ( References ) ( Miao M ingsan (苗明三)， Li Z h enguo (李振国 ) . Moder n Practical Quality Control Technique of Chinese Tradit i on- ) ( al Medicine(现代实用中药质量控制技术). Beiji n g(北京)：People's Medical Press (人民卫生出版社)，2000：900 ) ( 2 Blanco M， V illarroya I. Trends in Analytical Chemistry， 2002， 21(4)： 2 40~250 ) ( Woo Y A， Kim H J ， JungHwan C. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1999，2 1 ：40 7 ~413 ) ( 4 Yang Nanlin(杨南林)， C h eng Yiyu (程翼宇)， Qu Haibi n (瞿海斌). Chinese Journal of Analytical Chemistry，2003，31(6)：664~668 ) ( 5 Yang Nanlin(杨南林)， Qu Haibin(瞿海斌)， Che n g Yiyu(程翼宇). Journal of Chemical Engineering of ChineseUniversities (高校化学工程学报)，2004，18(1)：126~130 ) ( 6 Blanco M， Coello J， Iturriaga H . Chemometrics and Intellige n t Laborato r y System s ， 200 0 ，50 ： 75~82 ) ( 7 Hoeil Chung， Min-Sik Ku. Vibrational Spectroscopy， 2003 ， 31：125~131 ) Determination of the Coptis Extract Alkaloids UsingNear-Infrared Diffuse Reflectance Spectroscopy Qu Haibin， Liu Quan， Cheng Yiyu* istitute of Pharmaceutical In formatics， Zhejiang University， Hangzhou 310027) Abstract A quick and nondestructive method using near-infrared (NIR) diffuse reflectance spectros-copy was presented to determine the contents of berberine， palmatine， jatrorrhizine and total alkaloidof Coptis extract. Partial least square(PLS) was utilized to build the calibration models using secondderivative spectra with high performance liquid chromatography as a reference method for each compo-nents. Root mean square error of prediction (RMSEP) for berberine， palmatine，jatrorrhizine and to-tal alkaloid were 0.184， 0.109， 0.054 and 0.325， respectively. The recoveries were determined to be97.67%~99.59%，96.63%~100.70%，95.15%~101.15% and 97.41%~99.89% for berberine，palmatine， jatrorrhizine and total alkaloid， respectively. The relative standard deviations were 0.3%for berberine，0.6% for palmatine， 1.8% for jatrorrhizine， and 0.3% for total alkaloid， respectively.The results show that the presented method has a good reproducibility and stability and can be appliedto on-line detection in industrial process. Keywords Near-infrared diffuse reflectance spectroscopy， Coptis extract， partial least square， on-line detection ( ( R eceived 1 8 April 2003； accepted 17 November 2003) ) 本实验以黄连浸膏粉为对象HPLC作为参比方法"建立了对其中主要生物碱含量进行快速无 损测定的 1JX光谱分析法%该方法的分析结果准确可靠"重现性$稳定性和加样回收率均良好"可望发 展为一种植物提取物有效组分含量的快速测定方法。