核苷酸、β - 环糊精及硼酸盐的络合作用中核苷酸分离检测方案(毛细管电泳仪)

分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)第22卷第3期2003年5月Vol.22 No.3May 2003 周文峰等：核苷酸与β-环糊精及硼酸盐的络合作用在高效毛细管电泳分离核苷酸中的应用第3期9 核苷酸与β-环糊精及硼酸盐的络合作用在高效毛细管电泳分离核苷酸中的应用 周文峰，李向军，张裕平，袁倬斌 (中国科学技术大学研究生院应用化学研究所，北京1(100039) 摘 要：核苷酸和β-环糊精(B-CD)及硼酸盐之间存在络合作用，可应用于核苷酸的高效毛细管电泳分离，在10 mmol/L B-CD 和 20 mmol/L 硼酸盐存在时，实现了8种单磷酸核苷酸的分离测定；讨论了 pH 值、B-CD 浓度、硼酸盐浓度及分离电压对分离和络合作用的影响。 关键词：高效毛细管电泳；核苷酸；络合作用 中图分类号：0657.8；Q524 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2003)03-0008-03 核苷酸的分离测定广泛应用于生物化学、药学、农业、食品等领域。在核苷酸的分离测定中，高效液相色谱(HPLC)和高效毛细管电泳(HPCE)应用较为广泛。其中，HPCE 由于其高效、快速、进样量小等特点，愈来愈受到人们的重视。 3-环糊精(β-CD)和硼酸盐常用于毛细管电泳的分离中。有研究表明，环腺嘌呤核苷酸(cAMP)、脱氧腺嘌呤核苷酸(dAMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)与 B-CD 都有一定的络合作用1，.硼酸盐也常作为缓冲溶液用于核苷酸的 HPCE分离12~4J。Tadey等15I和 Vargas 等161曾利用核苷酸与这两种化合物的络合作用，分别对一些核苷酸及核苷酸类似物进行了分离。作者在前人工作的基础上，成功实现了包括次黄嘌呤核苷酸(IMP)、胸腺嘧啶核苷酸(TMP)等6种5'-单磷酸核苷酸在内的8种核苷酸的分离，并讨论了它们与 B-CD 及硼酸盐的络合作用。 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACS2000 型高效毛细管电泳仪(中国科学院研究生院应用化学研究所)；高压电源(0~30kV)；S200 型可变波长(0~800nm)紫外检测器(美国热电集团产品，装有专用型毛细管流通池)；压差式进样；石英毛细管柱(河北永年光纤厂)，有效长度60 cm； pH-3C 型酸度计(上海雷磁仪器厂)。 所用核苷酸均为生物试剂，购自 Sigma 公司，NaOH、硼砂(分析纯，北京益利精细化学品有限公司)，氨基乙酸、NaCl(分析纯，北京化学试剂公司)， B-CD(分析纯，南开大学精细化学实验厂)，实验用水为石英二次蒸馏水。 1.2样品制备 样品用缓冲溶液配制，微孔滤膜过滤，储存在冰箱中备用。 1.3 实验方法 实验前先用 0.1 mol/L NaOH 冲洗毛细管 5 min， 再分二用二次蒸馏水和缓冲溶液冲洗2 min。 采用阳极端手动压差进样。 每两次运行之间依次用0.1 mol/L NaOH、H0、缓冲溶液冲洗 2 min。缓冲溶液用1.0 mol/L NaOH调节至所需 pH值。毛细管电泳工作条件如下：检测波长254nm；进样压差10 cm， 时间10s；操作温度为室温；数据记录采用 ACS2000软件。 当混合标准溶液各组分达到基线分离时，采用分别提高单组分物质的浓度，根据其峰高的相应变化对谱峰进行定性。 2结果与讨论 2.1 硼酸盐浓度对分离的影响 硼酸盐浓度对迁移时间的影响如图1所示。总体上迁移时间随硼酸盐浓度增大而延长。这是 ( 收稿日期：2002-06-11；修回日期：2003-03-12 ) ( 基金项目：国家自然科学基金资助项目(20175025，29875027)；“十五”国家重大科技攻关项目(2001BA2104) ) ( 作者简介：周文峰(1976-)，女，河南延津人，博士研究生；袁倬斌，联系人. ) 因为离子强度变大导致Zeta 电位降低，电渗流减小。 1，2-顺式二醇和硼酸离子之间存在络合作用。在8种核苷酸中， cAMP、dAMP、TMP 不存在1，2-顺式二羟基，因此不能和硼酸盐形成络合物，迁移时间随硼酸盐浓度变化较小，其余5种则变化较大。这是因为与硼酸盐络合后带有更多的负电荷，与电渗流方向相反的运动速度增大所致。 当硼酸盐的浓度为 20 mmol/L时，可以实现8种核苷酸的基线分离。考虑到分离时间的原因，选择硼酸盐浓度 20 mmol/L 为最佳浓度。 2.2β-CD浓度对分离的影响 B-CD 浓度对核苷酸迁移时间的影响如图2所示。在 B-CD 存在的情况下，迁移时间总体上随 B-CD浓度增大而减小。这可能是因为 B-CD 参与了络合，与核苷酸和硼酸盐之间的络合作用存在竞争，而核苷酸与硼酸盐的络合作用对迁移时间的影响较强，导致了迁移时间的这种变化。另一方面，硼酸盐也可能与 β-CD 存在络合作用，进一步降低了硼酸盐与核苷酸之间的作用以及对电渗流的影响。Tadey 等5]认为因为嘌呤类核苷酸的环大， 3-CD 对含嘌呤碱基的核苷酸易于形成包结，而环小的嘧啶类核苷酸则不易形成包结；并讨论了在没有硼酸盐的情况下 β-CD 浓度对分离的影响。 但是，通过试验，当存在20 mmol/L 硼酸盐时， UMP 和GMP 的电泳行为表现一致，说明硼酸盐的存在对β-CD 与核苷酸的络合有一定的影响。该结果与 Var-gas 等16]的实验结果吻合。B-CD浓度为 10 mmol/L时实现了8种核苷酸的基线分离。 2.3pH值对分离的影响 pH值对核苷酸迁移时间的影响如图3所示。. 随着pH值的增高，迁移时间总体上随之增加，当pH值从9.0到9.7时，增加更为明显，这是因为5'-核苷酸-硼酸盐络合物在高 pH 值时因硼酸盐的自由羟基离子化(pK。=9.14)而带更大的负电性。从图3可知：在pH 8.5~9.0之间， IMP 和 UMP 的出峰顺序发生了变化，这是因为 IMP 的pK 为 8.9，在pH=9.0时，带有更大的负电性；在pH9.0~9.7之间，因1位存在类似氨基的氮显示酸性的 GMP(pk=9.4)和环上所有氮均呈碱性的CMP(pK，=4.5)出峰顺序也发生变化，对呈酸性的 UMP和呈碱性的 IMP 也能观察到同一现象；对呈酸性的TMP(pKa=10)，由于 pH值变化未到其pK值，所以没有观察到类似的现象。实验选择pH 9.0为最佳pH值. 2.4 分离电压对分离的影响 分离电压对迁移时间的影响如图4所示。 随着分离电压的增高，峰形变好且分离时间变短，但分离度变差，直至不能完全分离。实验选择的分离电压为22.5kV。 图1 硼酸盐浓度对迁移时间的影响 Fig.1 Effect of borax concentration on migrationtime separation conditions： buffer 50 mmol/L glycine- 15mmol/L NaCl - 10 mmol/L B-CD， pH 9.0； appliedvoltage 20 kV 2B-CD 浓度对迁移时间的影响 Fig.22Effect of B-CD concentration on migrationtime， separation conditions： buffer 50 mmol/L glycine -15mmol/L NaCl - 20 mmol/L borax， pH 9.0； appliedvoltage 20 kV 图3pH值对迁移时间的影响 Fig.33Effect of pH on migration time separation conditions： buffer 50 mmol/L glycine -15mmol/L NaCl-10 mmol/L B-CD -20 mmol/L borax， 2.5 最佳分离条件下的谱图 在最佳分离条件下得到的分离谱图如图5所示。 图4 分离电压对迁移时间的影响 Fig.4 Effect of applied voltage on migration time separation conditions： buffer 50 mmol/L glycine -15 mmol/LNaCl- 10 mmol/L B-CD- 20 mmol/L borax， pH 9.0 3结 论 核苷酸是一类重要的生物分子。B-CD 和硼酸盐与核苷酸都有一定的络合作用，这种络合作用.能有效地用于核苷酸的毛细管电泳分离，实现8种核苷酸的基线分离。 ( 参考文献： ) ( 1 HOFFMAN J L， BOCK R M. C h romatography of nucleic aci d components on cyclodextrin gels [J]. Anal Biochem， 1970， 33 (2)：209-217. ) ( 21 LANDERS J P， ODA R P， SCH U CHARD M D， et al. Sep a ration of boron-complexed diol compounds using high-performance capillary eletrophoresis[ J ]. Anal Che m ， 1992， 64(22 ) ： 2846-2851. ) ( 3 NG M， B L ASCHKE TF， ARIAS A A， et al . Anal y sis of free i ntrace l lular nucle o tides usin g high-performance capillary eletrophoresis[ J] . Anal Chem， 1992， 6 4 (15) ： 1682-1684. ) ( 4 LIU H W， QIS Z， ZHA N G Y N， et a l . Determ i nation of inosine 5'-mo n ophosphate and guanosine 5'-monophosphate in pig feed by capillary zone electrophoresis [ J ] . J High Resol Chromatogr， 1997， 20(4 ) ：242-24 4 ) ( 5 TADEY T， PURDY W C. Cap i ll a ry electrophoretic sepa r ation of nuc l eotide isomers via complexation wi t h cy c lodextrin anc borate[J]. J Chromatogr， B ， 1994， 657(2) ： 365-3 7 2. ) ( 6 VARGAS G， RE V ILLA A， HAVEL J， et al. Ca p illary eletrophoresis separation of the new anti-AIDS agent 9-(2-phosphonyl-methoxyethyl)adenine and 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)-2，6-diaminopurin inmixtures with some monoribonucleotides or the most common deoxynucleotides[J] . Electrophores i s， 1998，19(16-17)：2926-2929. ) High Performance Capillary Electrophoretic Separation of Nucleotidesvia Complexation with B-Cyclodextrin and Borate ZHOU Wen-feng， LI Xiang-jun， ZHANG Yu-ping， YUAN Zhuo-bin* (Institute of Applied Chemistry， Graduate School， University of Science & Technology of China， Beijing 100039， China) Abstract： The electrophoretic behavior of nucleotides can be manipulated using complex-forming reactions with B-cyclodextrin(B-CD) and borate. A mixture of 8 monophosphate nucleotides can be separated by high performancecapillary electrophoresis using a buffer containing 20 mmol/L borate - 10 mmol/L B-CD. The effect of pH， con-centrations of B-CD and borate， and separation voltage on the separation and complexation are discussed. Key words： High performance capillary electrophoresis； Nucleotides； Complexation ( * Corresponding author )