氮基酸中主要成分含量分析检测方案(毛细管电泳仪)

分析检测Science and Technology of Food Industry 分析检测Vol.25，No.2，2004 高效毛细管电泳—紫外检测法分离测定氨基酸的含量 (广西工学院轻工化工系，柳州545006) 孔红星 刘正西 伍时华 李利军 摘 要：利用高效毛细管区带电泳直接紫外检测法对8种非衍生化氨基酸进行了分离分析条件件研究，采用重力进样，进样高度20cm，进样时间 30s，弹性石英毛细管内径75pm，有效分离长度48cm，分离电压-20kv，在浓度为 50mmol/L，pH10的硼砂缓冲溶液中加入0.5mmol/L 的十六烷基三甲基溴化铵作为电渗流改性剂，在 4min 内，8种氨基酸得到了有效分离。各氨基酸的线性范围为 5~150pg/mL或1~80pg/mL，检出限在 0.5~2pg/mL之间。应用于由糖蜜生产亮氨酸的发酵液中缬氨酸和亮氨酸含量的测定，结果满意。 关键调：高效毛细管电泳，紫外检测，氨基酸，亮氨酸，缬氨酸 Abstract：8 nativeeaminoacidsswere separateddanddetermined in 4 minutes by high performancecapillary electrophoresis with UV detection. Theseparation and determination conditions were asfollows： gravitation sampling， the time is 30 sec，the height is 20 cm；running voltage， -20kv；bouncy silica：75pm i.d.，ttotal length 70 cm，37cm from the inlet to UV detection；eelectrolyte，50mmol/Lsodiumi tetraborateandid0.5mmol/Lcetyl trimethyl ammonium bromide，pH=10. Thelinear ranges is 5~150pg/mL or 1~80pg/mL，0.5~2pg/mL， r is more than 0.995. This newmthe yfethod could be used to determine the valineand leucine in the fermentation liquor during theproducing of leucine from molasses. The resultwas proved to be satisfactory. Key words：high performance capillary electrophoresis； UVdetection； amino acid； valine； leucine. 中图分类号：TS201.2*4 文献标识码： A l文章编号：1002-0306(2004)02-0140-02 高效毛细管电泳直接紫外检测法只在少数含有芳香基团的氨基酸的分离检测方面有报道，在不含芳香基团的氨基酸的分离检测方面未见报道。本文利用高效毛细管区带电泳直接紫外检测法研究了八种不含芳香基团的氨基酸的分离与测定，提出了一种氨基酸高效毛细管电泳分离与测定的新方法，并应用于由糖蜜发酵生产亮氨酸的发酵液中亮氨酸和缬氨酸的含量的测定，取得了满意的结果。 ( 收稿日期：2003-06-24 ) ( 作者简介：孔红星(1967-)，男，工程师，研究方向：分析化学。 ) 材料与方法 1.1 材料与仪器 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、硼砂、氨水、氯化铵、磷酸氢二钾、氢氧化钠 均为国产分析纯；甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸 均为生化试剂；溶剂为二次蒸馏水，所有溶液均经0.45jum微孔滤膜过滤，并用超声波脱气5min。 ACS2000 型高效毛管管电泳仪、负电源(电压0~30kv 可调)、毛细管(D=75pm，总长 70cm，用于分离的有效长度为48cm) 以上仪器均为北京彩陆科学仪器有限公司提供；UV-2102PC型紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司。 1.2 试验条件 实验室环境温度24℃，重力进样，进样高度 20cm，进样时间30s，电压-20kv，于 200nm阳极直接检测。 1.3 样品处理 取一定量由糖蜜发酵生产亮氨酸的发酵液经离心沉淀后，用二次蒸馏水稀释，经0.45um 的滤膜过滤，超声脱气 5min 后用于测定。 2 结果与讨论 2.1 分离条件的选择 2.1.1 缓冲溶液的选择 利用直接紫外检测，背景电解质应具有较低的紫外吸收，本文研究了硼砂、磷酸氢二钾、氨水三种具有较低紫外吸收的缓冲溶液。试验表明，硼砂和氨水具有较好的分离效果，而磷酸氢二钾具有较大的电泳电流，基线稳定性差，而氨水易挥发，且对人体有刺激，故选取硼砂作缓冲溶液，硼砂浓度增大，分离效果提高，但浓度太高会使电泳电流过大，影响分离测定，本文选用 50mmol/L的硼砂作为缓冲溶液。 2.1.2 pH的选择 在酸性介质中，氨基酸带正电易被毛细管壁吸附，因而通常在碱性介质中实现氨基酸的毛细管电泳分离。在碱性介质中，pH升高，分离效果提高，但过高的pH对毛细管的使用不不，且会使基线不稳，本文选取 pH10，取得了较好的分离效果。 2.1.3 改性剂的选择 在碱性介质中，氨基酸以阴离子的形式存在，在电泳过程中会向阳极移动，其流动方向与电渗流方向相反，会使分离时间延长。试验表明，在不使用改性剂时，本文所用的8种氨基酸在30min 内均未出峰。本文采用常用的十六烷基三甲基溴化铵作为电渗流改性剂，当分离电压为20kv 时，4min内8种氨基酸的吸收峰全部出现，改性效果良好。十六烷基三甲基溴化铵的浓度提高会降低电泳电流，对分离有利，但效果提高不显著，同时会使分离时间延长，本文使用 0.5mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵作为电渗流改性剂。 2.1.4 检测波长的选择 紫外检测是应用最广泛的检测方式，但用紫外检测法直接测定非衍生化的氨基酸含量未见报道。目前，很多文献报道称，只有少数带有芳香基团的氨基酸可用紫外检测，而大多数须用带生色团的衍生试剂衍生，方可检测11.2。本文研究了通常认为不能用紫外检测的8种氨基酸，发现大多数氨基酸都具有紫外吸收，一般在195nm附近具有最大吸收(见图1)，当波长大于195nm 时，波长降低，多数氨基酸的灵敏度提高，但基线噪音加大，本文考察了195、200、210、220nm四个波长，结果表明，200nm处具有较高的灵敏度和稳定性，因而本文选用 200nm 作为检测波长。 图1 氨基酸的紫外吸收光谱 亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸如曲线1，甲硫氨酸、赖氨酸如曲线2(浓度为1mg/mL)。 2.2 氨基酸的分离 在选定的电泳分离条件下，8种氨基酸在 4min内达到完全分离，分离图谱见图2。 2.3 定量方法研究 在选定的毛细管电泳分离条件下，对8种氨基酸的定量方法进行了研究：a.重重性(浓度为30pg/mL，n=8)：迁移时间的相对标准偏差RSD 小于0.82%，峰面积的RSD 在1.1%~3.5%之间；b.线性范围：甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸为5~150pg/mL，甲硫氨酸、赖氨酸为1~80pg/mL，线性相关系数大于0.995，甲硫氨酸和赖氨酸的检测限为 时间(min) 图2 氨基酸的分离图谱 图3 发酵液的分离图谱 0.5p.g/mL，其它氨基酸的检测限为1~2ug/mL 之间。 2.4 样品分析与加标回收率试验 取一定量的发酵液，按1.3的方法处理后，用于高效毛细管电泳的分离与测定，并做加标回收试验，内标法定量，谷氨酸为内标物，分离图谱见图3，测定结果见表1。 3 结论 利用高效毛细管电泳——紫外检测法这种成熟的技术，分离与测定氨基酸的含量是可行的，该方法重现性好，精确度、灵敏度高，样品处理简单，是一种快速、简便、经济的分离分析方法，可替代高效液相色谱仪和氨基酸分析仪用于氨基酸的分离与测定，具有广阔的应用前景。 ( 参考文献： ) ( 周琼，陈鑽光，莫金垣.毛细管电泳在氨基酸分析中应用的 进展[J].现代医学仪器与应用，2002，14(1)：9~11. ) ( 21 傅若农，顾峻岭.近代色谱分析[M].北京：国防工业出版社， 1998.282. ) 表1 样品分析结果(n=8，ug/mL) 测定平均值 RSD(%) 加标量 加标测定值 加标回收率(%) 发酵液中的含量 缬氨酸 47.1 2.6 10 56.6 95 9420 亮氨酸 49.6 3.3 10 59.4 98 9920 第期方数据 第期