微生物中分离检测方案(毛细管电泳仪)

微生物学杂志 2005年7月第25卷第4期 JOURNAL OF MICROBIOLOGY July 2005 Vol.25 No.477 微 生 物 学 杂 志25卷78 毛细管电泳在微生物分离与检测中的应用 杨玉志1，2，张春秀1，唐祖明1*，陆祖宏1* (1.东南大学生物科学与医学工程系分子与生物分子教育部重点实验室，江苏南京 210096；2.南京市鼓楼医院，江苏南京 210008) 摘 要 毛细管电泳在分离与分析无机离子、有机小分子、生物大分子(如蛋白质、核酸)和微生物(细菌、病毒)等方面应用十分广泛。着重论述了毛细管电泳在微生物分离与检测方面的基本原理、早期探索、存在问题和最新进展。 关键词 毛细管电泳；微生物；细菌；病毒 中图分类号Q331 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)04-0077-05 Application of Capillary Electrophoresis in Microbe Separation and Detection YANG Yu-zhil，2， ZHANG Chun-xiu'， TANG Zu-ming'， LU Zu-hong (1. Key Lab of Molecule and Biomolecule under Minist. ofEducat. Dept. ofBiomedical Engin. SE Univ.， Nanjing 210096；2. Nanjing Gulou Hosp. Nanjing 210008) AbstracttCapillary electrophoresis can be used to isolate and analyze a wide variety of inorganic and organic smallmolecules， bio-macro-molecules (such as proteins， nucleic acids)， and microbes (bacteria， viruses). Basic principle，early exploration， the existing problems， and the newest progress of it in microbe separation and detection were em-phasized. Keywordscapillary electrophoresis； microbe； bacteria； virus 自从1980年毛细管电泳(Capillary Elec-trophoresis，CE)技术诞生以来，随着有关毛细管电泳理论研究的不断深入和检测方法的不断完善，毛细管电泳技术以其快速、高效、高灵敏度、重复性好及易于实现全自动操作等优点，广泛应用于化学、生物学、医学、环境卫生等各个方面。尤其是二极管阵列、激光诱导荧光、质谱、拉曼光谱、安培法、电导法等检测技术与毛细管电泳的结合，使得毛细管电泳技术达到前所未有的高度。但是，不同于毛细管电泳在无机离子、有机小分子和生物大分子(如蛋白质、核酸)等方面取得的巨大成功，毛细管电泳在微生物方面的应用在最近几年才取得较大进展，并逐渐显现出巨大的应用潜力。本文主要介绍毛细管电泳在微生物分离与检测方面的应用。 利用毛细管电泳进行微生物分离与检测的基本原理 毛细管电泳是指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间电泳淌度和分配行为上的差异而实现高效快速分离的一类液相分离技术。依据样品组分在缓冲液中所受作用的不同，毛细管电泳的操作模式可以分为毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)和亲和毛细管电泳(ACE)等11。毛细管电泳技术以其快速、高效、高灵敏度、重复性好及易于实现全自动操作等优点，广泛应用于化学、生物学、医学、环境卫生等各个方面。 在微生物学领域，长期以来微生物的鉴定方 ( 收稿日期：2004- 1 1- 1 6 ) ( 作者简介：杨玉志 男，硕士生。从事毛细管电泳研究。 ) ( 基金项目：国家自然科学基金(60223002)；国家863高科技基金项目(2002AA2Z2041、2004AA30207) ) 法主要是19世纪就开始使用的纯菌种分离法，不仅花费时间长，而且只能对有限的微生物种类进行逐个检测。另外微生物的定量检测手段极其有限，至今没有一种现代仪器分析方法适用于微生物的定量检测。人们常用的各种手工和自动细胞计数仪只能适用于纯菌种，对混合微生物样品则无法直接分析，而且结果也与实际数目误差较大。自从1987年 Hjerten 等人报导利用毛细管电泳分析烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和干酪乳杆菌(Lactobacillius casei)[2]以来，有关微生物的毛细管电泳检测被不断报导，成为毛细管电泳的一个重要研究方向。 大多数微生物，如细菌、病毒等的外层由蛋白质外壳、糖蛋白膜或细胞壁构成，其外层在大多数情况下带电。细菌细胞壁的化学特性不仅决定表面电荷，而且决定该细菌是革兰氏阳性或阴性。革兰氏阴性(G)菌表面有磷脂双层的胞质膜和细胞壁，细胞壁内层为很薄的肽聚糖层(仅1~2层)，其外还有3层结构，由内向外依次为脂蛋白、脂质双层和脂多糖。这些复杂的结构使 G菌表面电荷增多；革兰氏阳性(G*)菌的胞壁中无脂质双分子层，但肽聚糖层很厚(15~50层)，肽聚糖层外面富含磷壁酸。细菌有带电现象，G+菌等电点(PI)为2~3，G菌等电点(PI)为4~5，故细菌在中性或弱碱性环境中带负电，当 pH≥5时，G-菌达到等电状态，而 G*菌仍可带负电荷[3]。病毒的外层为蛋白质层，蛋白质的氨基酸残基使病毒带电荷。真菌的细胞壁含蛋白质和脂肪膜，使其带有特征电荷。上_述微生物所带电荷随pH值、离子强度、离子成分和温度等条件的变化而变化[4]。同其他所有带电胶体一样，微生物胶体的电特性使其在毛细管内壁形成双电层，这是微生物毛细管电泳的前提条件。 Schnabel等人151报导了电迁移率(u)与 Zeta电势(E)、缓冲液电导率(e)、缓冲液黏度(m)和粒子大小(r)之间的关系式： 式中，f(kr)是一个无单位的参数，其取值范围在1~1.5之间，随r变化。 在直流电场作用下，微生物胶体的电迁移率也满足此关系式。由上式看出，在直流稳压电场作用下，缓冲液的离子强度、pH值、微生物的大小 等因素均会影响微生物的电迁移率。不同种类微生物电迁移率的不同，使得利用毛细管电泳法分离分析微生物成为可能。 2 毛细管电泳进行微生物分离与检测的难点及影响因素 毛细管电泳设计的最初目的是用于分析各种分子，但是即使是最大的分子，与微生物相比，其体积和结构复杂性也要小许多。例如，葡萄糖分子长度只有1.5 nm，而细菌可以达到10 um长。这种体积和复杂程度的提高，使得微生物的毛细管电泳分析与分子相比复杂很多。 除了体积和结构复杂之外，微生物的毛细管电泳还要考虑其他因素。首先，大多数微生物难以得到纯菌种，使得样品的制备十分困难。其次，微生物都是双极性的，在高 pH值时带负电，在低pH 值时带正电，因此缓冲液的 pH 值也是一个重要影响因素。微生物的溶液稳定性差，对环境(如pH 值，离子强度和含氧量等)非常敏感，随着时间的延长可能会出现繁殖、溶解等现象。另外许多微生物容易聚集成长链或簇等大小不同的聚合体，吸附到其他微生物或毛细管内壁，从而影响电泳结果。大部分微生物还会分泌某些物质，这些分泌物会引起电泳速度改变或产生一些不利于分离的影响，并可能造成假峰或异常峰。与其他分子的溶液相比，微生物溶液的非均质性和复杂性，造成微生物样品进样和分析上的困难困61。 以上这些因素造成微生物的毛细管电泳不如小分子那么容易控制和预测，若实验条件控制不当，经常会得到重复性很差、没有任何意义的电泳图谱。 3 毛细管电泳进行微生物分离与检测的早期探索 1987年，Hjerte'n 等人首次报道了利用毛细管电泳分析微生物的实验[21。他们利用甲基纤维素修饰的毛细管分别分析了烟草花叶病毒(TMV)和干酪乳酸菌(L.casei)。缓冲液的 pH值为8.5，毛细管内径为100 um(带有甲基纤维素或线性聚丙烯酰胺涂层)，利用紫外检测器，在260 nm检测TMV，在220 nm 检测 L. casei。得出的电泳图谱显示4 min 内有比较标准的电泳 峰，但是没有区分出微生物的种类。他们的实验首次证明了利用毛细管电泳分析微生物的可行性。 1989年，竺安和陈义进行了毛细管区带电泳分析多种红细胞(人、鸡、猪和兔)的实验71。他们在缓冲液中加入羟基丙烷甲基纤维素，获得了重复性很好的 CE 图谱。他们发现不同物种的单个红细胞的保留时间差别很大：人14 min 左右，兔26.6 min 左右，鸡 28.3 min左右，猪32.8 min左右。如果把这些红细胞混合在一起做 CE 分析，也得出比较好的互不影响的分离结果。竺安和陈义首次提出了电泳图谱上异常尖峰的出现可能是细胞聚集的结果，同时证明峰高和进样的细胞量相关，红细胞样品保存时间的长短也直接影响出峰时间。 1993年，Ebersole 和 McCormick 利用毛细管区带电泳进行了细菌分离的实验[8]，他们能够将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、化脓性链球菌( Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococ-cus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneu-moniae)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus au-reus)全部或部分区分成离散的区带。他们认为整个实验过程中90%的细菌保持活性。他们利用传统细胞电泳的方法，建立了细菌电泳的电泳速率匹配法。实验中，他们使用的毛细管内径为100m，长度达到250 cm以保证样品在足够的分离时间内互相分开。电泳实验结果显示与粪肠球菌相对应的2个峰，第1个峰代表该细菌的特征峰，另一个峰他们认为是该类细菌聚集形成的异常峰。另外他们提出细菌表面电荷的多少直接影响电泳速率。 1997年， Pfetsch 和 Welsch 也做了分离3种细菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌(Pseudomonas species)和富营养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的类似毛细管电泳实验91，实验条件基本与 Ebersole 和 McCormick 的实验条件一致，毛细管内径为250um，长度也是250 cm。结果表明分离时间稍有缩短，但是带宽基本一致。他们测出了不同缓冲液 pH 值和离子强度下的电泳速率。在 pH 值为9.6时，如果离子强度的范围在2~10 mmo/L之间，测出的电泳速率范围是20~30m/(v's-1)。 从早期微生物毛细管电泳的实验可以看出：实验用的毛细管较长；只有不同微生物的电泳速率差异足够大时，才能实现微生物的电泳分离；与小分子相比，微生物电泳的峰形不够标准，而且带宽较大。尽管存在困难，但这些早期实验给微生物的毛细管电泳奠定了较好的基础。 4 毛细管电泳在细菌分离与检测方面的最新进展 自1999年以来，毛细管电泳在细菌分离分析的最新进展以美国 Armstrong 小组为代表，他们建立的微生物毛细管区带电泳(capillary zoneelectrophoresis， CZE)方法，可以在短时间对微生物样品进行分离，得到的峰形很尖锐，而且柱效很高。其中的关键就是他们在缓冲液里添加了浓度很低[o(0.025%)质量比]的聚合物添加剂(聚环氧乙烷)，其作用不仅表现在降低电渗流上，而且不同浓度的添加剂对微生物的电泳淌度的影响也不一样。在实验中他们使用内径100 um，长度为27 cm 的毛细管，在10 min 内成功实现了对Ｍ.luteus、产气肠杆菌(E. aerogenes)、荧光假单胞菌(P. fluorescens)和酿酒酵母(S. cerevisiae)的有效分离。使微生物的毛细管电泳首次在毛细管内径长度、分离时间、峰分辨率和柱效等方面达到小分子的水平。Armstrong 小组还发现，缓冲液的成份、pH值、离子强度、聚合物添加剂的种类和分子量、加入添加剂后缓冲液的保存时间以及微生物的处理方法等许多因素都会对微生物的电泳行为产生影响[61。 Shiniani 等人也采用了在缓冲液中加入低浓度聚合物添加剂的方法，他们加入的是藻酸钠聚合物，分离某些沙门氏菌，得到很好的分离效果。他们发现，在缓冲液中加入0.01%的藻酸钠后，肠类沙门菌(S. enteritidis)的电泳峰有很大改善，但是对鼠伤寒沙门菌(S. typhimurium)的作用不大。他们还发现进样的细胞数与检测信号之间有很好的比例关系[10]。 Girod 等人对有关低浓度聚合物的作用机理进行了深入研究11]。实验中，他们利用带有激光诱导荧光的 CCD 记录毛细管电泳的动态图象，发现在细菌的毛细管电泳中，特定条件下会发生电泳峰的压缩现象。他们还研究了产生和影响峰压 缩现象的几个因素，离子强度的提高使峰的出现更快，峰形更尖锐；但是提高 pH 值，有可能改变细菌的极性，使细菌向阴极移动，反而降低电泳速率。通过对不同聚合物添加剂的比较，发现聚烯吡酮也能产生峰压缩现象，但是聚丙烯酰胺不能。改变聚合物添加剂的分子量也会影响峰压缩，但是分子量太大时反而使出峰时间延长了。 J. Zheng 等人对含有低浓度聚合物的作用机理提出了另外一种观点[12]。他们在配有 CCD 的显微镜下直接观察单个细菌的活动，在电场作用下，单个细菌的方向与电场方向之间的夹角不一样，导致他们的运动速度也不一样。0°方向的细菌运动速度最快，而90°方向的细菌运动速度最慢。由于运动速度不同，细菌在运动过程中互相碰撞、聚集，而且随着聚集的细菌数量增加，这些聚集形成的细菌聚合体也导致了电泳峰变窄，看上去更加标准。 5毛细管电泳在病毒分离与检测上的研究进展 有关病毒毛细管电泳的报道最早见于 1987年，Hjerte'n 等人利用甲基纤维素修饰的毛细管分析了 TMV，得出了 TMV 的电泳图谱[2]。后来Grossman 和 Soane 再次研究了 TMV 的电泳特性13]，证明了病毒的方向性对其电泳速率有影响。由于病毒大多是杆状的，不同的方向性会导致病毒与周围缓冲液之间的摩擦力不同。电场强度越高，病毒与电渗流的方向越趋于一致，摩擦力越小，电泳速率越快。 Kenndler 和他的助手发表了多篇有关人鼻病毒(human rhinovirus， HRV)毛细管电泳的文章。1996年他们发表了第一篇有关 HRV 等电点的文章[14]。之后一篇文章证明了 HRV 的毛细管电泳图谱重复性很好[15]。他们在实验中发现在3.6min 左右都会出现一个较大的峰，而且通过实验证明了该峰是 HRV 的峰。首先加热 HRV 样品使其变性，导致 RNA 从蛋白质外壳中释放和其他结构变化。变性的样品再做毛细管电泳分析，3.6 min 的峰消失，却在4.8 min 左右出现另外一个峰。他们利用RNA 酶分别处理变性前后的样品，结果表明 RNA 酶对变性前的样品没有影响，3.6 min 的峰依然出现。但是对变性后的样 品，4.8 min 的峰消失，却出现了小峰，他们认为是RNA 降解产物的峰。由此证明 3.6 min 的峰是 HRV的峰。另外他们利用单克隆抗体使HRV 聚集，离心后取上清液分析，在电泳图谱上发现3.6 min 的峰有不同程度的减少，从而也证明了3.6 min的峰是 HRV 的峰。 Okun 等人利用毛细管亲和电泳(ACE)研究了 HRV 和某些单克隆抗体(mAb 8F5)之间相互作用的程度16]。实验中，随着与 HRV 结合的mAb 8F5 抗体量的不断增加，电泳图谱上与原始样品一致的峰其出峰时间发生变化，直到 mAb8F5的量超出一定范围，在图谱上出现了 mAb8F5 的峰。他们还证明 HRV14 与 mAb 17-IA之间也有类似的关系。他们还证明这个实验结果可以用于 HRV 与单克隆抗体之间相互反应的化学定量。将一定量的 mAb 3B10 与不断增加的HRV2 反应，HRV2 聚集离心后，用 CE 分析上清液，得出 mAb 3B10 的电泳图谱。通过绘制 mAb峰面积与所加入 HRV2 的量之间的关系曲线，发现他们呈线性比例关系。 除了鼻病毒之外，只有 Mann 等人研究了人腺病毒的毛细管电泳[17]。实验中，他们采用了聚乙烯醇涂层的毛细管，长度57 cm 左右，缓冲液是25 mmol/L 的磷酸钠溶液。他们发现如果毛细管不做涂层，由于病毒吸附到管壁，得到的电泳图谱是空的。涂层后得到的电泳图谱表明9~10 min 左右有一个主峰。最佳的缓冲液 pH值是7.0，浓度是 25 mmol/L。 6微生物毛细管电泳分离与检测的应用 6.1 药物中微生物的检测 尽管纯菌种培养法、PCR 和ELISA 法已经成功应用于药物中微生物的鉴定，而且 PCR 和ELISA 可以用于定量检测，但是这些方法操作复杂，费力，耗时(长达2h至3d)。2003年8月，Byoung-geoun Moon 和 Yongseong Kim 报导了CE 在检测药品和保健品中的微生物方面的应用[18]。他们在缓冲液中加入聚环氧乙烷，对分别含有酿酒酵母和粪肠球菌的2种药物进行毛细管电泳，毛细管直径100 um，有效长度40 cm，紫外检测器的波长为214 nm，在 30 min 之内都得 出了较好的分析结果，符合药品生产厂家提供的数据。他们的实验表明毛细管电泳方法可以对含有微生物的药品和保健品的生产过程进行质量控制，包括单位重量的药品中微生物的数目、纯度和存活率等。 6.2 .毛细管电泳在临床微生物检测中的应用 从微生物的毛细管电泳原理上看，那些由细菌引起的各类疾病应都可以用毛细管电泳方法来诊断。毛细管电泳不需要额外的纯菌种培养，直接分析样品即可；样品用量极少；分析速度快；可同时检测多种微生物，这些优势使得毛细管电泳在临床微生物检测方面的应用前景十分广阔。 以尿道炎为例，该疾病主要是由大肠埃希菌(E.coli)和腐生性葡萄球菌(S.saprophyticus)2种细菌引起。Armstrong 小组利用微生物的毛细管区带电泳方法检测并鉴定了人体尿液中的这2种菌[19]。在实验中，他们把尿液直接作为样品来分析。缓冲液的 pH 值为9.0，聚合物添加剂的分子量为100000。结果表明，如果尿液中含有大肠埃希菌或腐生性葡萄球菌，可以很容易的被检测出来。再利用标准样品对照法就可以判断病人感染了何种细菌。实验还发现，尿液的浓度会影响两种细菌的电泳淌度。 7 小 结 随着毛细管电泳的基本原理、检测技术和联用技术的发展，高效、快速的毛细管电泳分离分析方法会在很多涉及细菌、病毒、真菌、海藻和原生动物等微生物的分离、签别和定量分析方面有更加广阔的应用前景。 ( 参考文献： ) ( 林炳承.毛细管电泳导论[M].北京：科学出版社，1996 ) ( Hjerte'n S， Elenbring K， Kilar F . ， et a l. 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