大鼠全血中镁的形态检测方案(毛细管电泳仪)

Vol.28.No.6Dec.2008第28卷第6期2008年12月惠州学院学报(自然科学版)JOURNAL OF HU IZHOU UN VERSITY ·32·惠州学院学报(自然科学版)2008年第28卷 超声透析 CE-ICP-AES分析大鼠全血中镁的形态 李险峰，邓必阳2 (1.惠州学院化学工程系，广东惠州516007； 2广西师范大学化学化工学院，广西桂林541004) 摘 要：将超声波应用于微透析与 CE-ICP-AES联用技术，自行设计了超声透析装置，并将该联用技术用于大鼠全血中Mg的形态分析。实验优化条件为：融熔毛细管120 cm X100 um(ID.)；缓冲溶液 50 mmol· LTris -HC1(pH 7.4)；电泳电压18 KV。在该条件下分析出镁以四种形态存在于大鼠血液透析液中，并通过标准Mg的迁移时间及加标后迁移时间对透析液中游离镁形态进行了表征，峰面积定量透析液中游离镁的含量为24.2mgL，RSD <5%，该方法加标回收率为96.0%-103.6%。 关键词：超声波；微透析；毛细管电泳； ICP-AES；形态分析 中图分类号：O611.5 文献标识码：A 文章编号：1671-5934(2008)06-0031-05 毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点。电感耦合等离子体原子 发射光谱(ICP-AES)是一种灵敏的元素选择性分析方法，具有分析灵敏度高，多元素同时测定等优点。CE-IP-AES的联明，对微量样品中的微量元素形态分析是一种很有发展前途的分离检测法法。毛细管电泳进行复杂体系中小分子分析前，必须对样品进行净化处理。微透析是样品净化的有效方法，可与毛细管电泳在线联用13-51。章竹君等用透析-CE系统进行了大鼠、家兔16.7体内药物的动力学研究。邹汉法、张玉奎等18-101将微透析与其它分析技术联用对药物和蛋白质等进行了分析研究。透析与 CE及其它分析技术的联用在神经递质及药物动力学中亦有广泛应用11，12] 超声波可在液体中产生空化作用，其产生的冲击波和剪切力有利于小分子快速通过透析膜而达到内外溶液浓度的平衡。超声波可促进液相传质，它产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用可加速样品透过，提高透析效率，缩短透析时间4。将超声波引入血液透析，可直接促进膜两侧物质传质，从而提高透析效果，有利于生物样品的快速分离取样与分析。镁是血液和体液的必需组分，是细胞新陈代谢中各种酶系统的重要活化剂。人体中镁的存在形式有：游离镁、复合镁及蛋白结合镁等。分析镁在生物体中的存在形态能更好地了解它们在新陈代谢及细胞代谢等生化过程中的作用。本文首次采用超声波透析与毛细管电泳-电感耦合等离子体原子发射光谱(Capillary Electrophoresis Inductively Coup led Pla sma A tom ic Em ission Spectrometry，简称 CE- ICP-AES)联用技术对大鼠血液透析液中镁元素进行形态分析，在优化实验条件下对样品中游离态镁及各形态镁镁行了定量。为微量生物样品的实时分离分析提供一种新的分析方法。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 仪器：Optima2000 DV全谱直读电感耦合等离子体原子发射光谱仪(美国 PerkinEmer公司)；熔融硅石英毛细管(内径100um、外径375 um，河北永年锐沣色谱公司)；ACS 2000高压电源(北京彩陆科学仪器公司)；自组装毛细管电泳仪和毛细管电泳进样装置；超声波(上海科导超声仪器有限公司)； SYZ- 550石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏勤华玻璃仪器厂)；pHSJ-4A实验室pH计(上海精密科学仪器有限公司) ( 收稿日期：2008-07-01 ) ( 基金项目：国家自然科学基金 (No. 20565001)资助 ) ( 作者简介：李险峰(1980-)，男，湖北黄冈，硕士，助教，研究方向为光谱分析与联用技术、毛细管电泳、元素形态分析。 ) CE-ICP接口参照文献犬制作。该接口外观类似玻璃同心雾化器，雾化器中心管被毛细管所代替，毛细管出口端处以环氧树脂胶合铂丝作为电极，接口外端口长0.5 cm，内径0.5mm，样品出口端为负极。 ICP-AES工作气体为氩气，轴向观测。元素分析线：Mg279.553 nm。毛细管电泳和 ICP-AES工作条件如表1所示。 试剂：硫酸镁(广州化学试剂厂)；乙酸(广东汕头市西陇化学厂)；乙酸钠(广东汕头市光华化学厂)；37%盐酸(广州化学试剂二厂)；三(羟甲基)胺基甲烷(上海国药集团化学试剂有限公司)；肝素钠注射液(中国江苏万邦生化医药股份有限公司)。1000mg·L标准镁贮备液， 50 mmol·LTris-HC1 pH7.4缓冲溶液(均在4℃保存)，使用时逐级稀释至所需浓度。所用试剂均为分析纯，实验用水均为亚沸蒸馏水。 1.2 样品来源及前期处理 大鼠体重约200g，年龄60 d左右(桂林医学院提供)，动脉取血。血样直接流入内装抗凝剂肝素钠的离心管中(肝素是体内正常的生理成分，不改变血样的化学组成或引起药物的变化，不干扰本测定)。可将配制好的肝素溶液均匀地涂布在试管壁上，于60-70℃烘干备用。短期保存时需置于冰箱(4℃)中备用 1.3 超声波透析装置的组装 透析装置的样品盛放器为中空圆筒型 PTFE管(直径3mm)，开口一端由环氧树脂胶合透析膜而成，透析液管为0.5mlTeflon管，将样品管下端的透析膜浸入透析液中，再将两者置于超声波清洗器中超声透析，然后分别取不同时段透析液检测(装置示意图如图1)。 超声波清洗器：3200H型，电源：220V，50 Hz，工作频率：59 KHz，消耗功率：135W。透析膜：截留分子量MW-C015000(北京麒麟宏伟生物工程公司)。 表1 毛细管电泳及等离子体工作条件 毛细管电泳分离条件 ICP-AES工作条件 缓冲溶液 50 mmol·L RF功率 1300W Tris- HC1pH 7.4 冷却气流速15L·min 毛细管120 cm X100 umD 辅助气流速0.2L·min-1 电泳电压18 KV 载气流速0.8L·min 进样方式0.04MPa X10s 超声波透析装置 图1 自组装设计超声透析装置 1.4 平衡透析实验条件 血液盛放于一端胶合有透析膜(MWCO15000)的中空圆筒型 PTFE管(直径3mm)中，并置于 0.5mL Teflon管中在293K下静止平衡透析采样，取不同时段透析液用于分析检测。 1.5 透析液的引入及电泳分离 新毛细管用0.1mol·LNaOH冲洗 20min，后用缓冲溶液冲洗 30min。为保证迁移时间的重复性，每次实验进样前，用0.1mol·LNaOH，亚沸水和缓冲溶液依次各冲洗 3min。实验时先在毛细管中充满缓冲溶液再以0.04Mpa的氮气压力将透析液压入CE毛细管中，进样完毕后换为缓冲溶液加高压电源18 KV在293K温度下进行电泳分离，然后利用耳1ICP-AES来检测形态分离峰。所有样品及溶液均利用超声波振荡多10min以除去气泡防止电泳过程中出现电流断流现象。 2 结果与讨论 2.1 平衡透析与超声透析速度比较 以浓度为 60mg·L的Mg溶液为平行样品分别进行平衡透析和超声透析实验，透析液为10 mmol·LTris- Hcl pH 7.4溶液。相隔不同时段(透析时间段：5，10，15，20，30，40，50，60，120 min)分别取透析液进行 CE- ICP-AES微量进样检测其浓度，由图2可见，平衡透析时间较长，透过量少且离子浓度较低。而超声透析在相同时 间内透析量大，离子浓度高，较短时间内达到与平衡透析相同强度。在相同时间内超声透析效率优于平衡透析，超声透析一小时左右达到透析平衡，可为生物样品的分析提供方便快捷的分离分析方法。 2.2 超声波影响因素的讨论 采用超声波透析技术，操作简便，透析率高，样品用量少，但超声波振荡引起局部温度的剧烈上升，可能会破坏生物样品结构，影响其生物活性。血液样品一般适宜于4℃保持其生物活性，故在超声透析操作时应在底物中加入冰块进行冷却。 血液的成分主要包括水、电解质、血细胞、蛋白成分及多种酶类。其中水、电解质由于可以自由通过透析膜，超声对它们的透析效率影响较小。各种球蛋白、酶类、白蛋白、分子量都比较大，常以十万、百万计，不能通过透析膜，超声对它们的作用亦可以忽略。故其主要作用是产生震动加快无机离子的浓差透过(本实验截留分子量为15000)。 2. 3 毛细管电泳缓冲溶液类型、浓度及 pH值对分离效率的影响 毛细管分离效率取决于缓冲溶液类型、浓度及pH值，在试验中分别对 pH 7.4 Tris-HCl， pH 5.5 NaAc-HAc进行考察，结果表明： pH 7.4Tris-HC1缓冲液有利于血液透析液中镁元素形态的分离。同时采用20，30，50和80mmol·L pH 7.4Tris- HC1进行电泳分离，随着浓度增加，不同形态峰分离效果明显，但浓度过大时电泳电流较大产生焦耳热不利于生物样品分析。故本实验采用 50 mmol·L pH 7.4 Tris-HCl作为电泳缓冲溶液。 2.4 电泳电压对出峰时间和分离效率的影响 在 50 mmol·LpH7.4Tris-HC1作为电泳缓冲溶液时考察了电泳电压范围16-22KV对分离效率及出峰时间的影响。随着电压的增加迁移流出时间缩短不利有效分离样品，况且电泳电流也会随之增加，焦耳热效应明显。综合以上因素选择18 KV为电泳电压，在此条件下，样品形态分离效果较优。 2.5 大鼠血液超声透析液中镁元素的形态分析 在最佳实验条件下，对大鼠血液透析液中镁的形态进行分析，结果如图3所示。由于 ICP-AES元素分析线Mg279.553 nm的选择性，从图3中可以看出：Mg在大白鼠血液透析液中主要以四种化学形态存在，分别用Mgl至Mg4表示，各形态迁移时间如表2所示。 在大鼠血液透析液样品中加入 5mg·LMg标准溶液后在相同条件下电泳时的形态分析如图4所示。在图4中，加入标准游离镁溶液后Mgf迁移时间为650s，其峰高明显增大，而其它位置的形态峰的强度几乎无变化。从电泳分离图5可以看出：浓度为5mg·L标准Mg的迁移时间为636 s，即游离态镁的迁移时间。从迁移时间来看，Mg3的迁移时间为645 s，游离态镁的迁移时间为636 s，而加入标准镁溶液后在650s处的形态峰峰高显著增高，三者形态峰迁移时间非常吻合，其迁移时间的偏差小于3%，依此可以判断 Mg3为游离态镁。 由图3可知，Mg1，Mg2，Mg3，Mg4这些形态峰的分子量均≤15000，结合图4与图5，可以判定 Mg3为游离态镁；同时判断Mg1，Mg2，Mg4为小分子复合镁或是蛋白结合镁，由于缺少相应形态的标准以及生物体内的复杂性，该三种峰的具体形态，有待进一步探讨。 图2 Mg的平衡透析与超声透析速度比较 图3 大鼠血液透析液中Mg的形态分析 图4 大鼠血液透析液中加标后镁的形态分析 图5 浓度为5mg.L标准镁的形态分析 2.6 血液透析样品中游离态镁的定量及其他形态镁的估算 利用 CE-ICP-AES联用技术对大鼠大鼠血液超声透液液中的Mg进行了形态分析，从分离形态峰来看，透析液中Mg主要以四种形态存在。由峰面积来计算游离镁含量及估算其它形态镁的含量如表2所示，其中游离态镁的含量为24.2mg·L 表 2 血液透析液中Mg的形态分析及定及(n=10) 镁形态 迁移时间 (S) RSD(%) 含量(mg·L) RSD(%) Mg0 636 1.9 5.0 2.1 Mgl 466 2.1 8.4 2.9 Mg2 616 3.7 15.3 4.3 Mg3 645 2.2 24.2 1.7 Mg4 783 3.9 3.3 4.6 2.7CE-ICP-AES联用技术检测大鼠血液透析液的精密度、检出限及加标回收 在最佳实验条件下，对血液透析液电泳测定10次，求得各种形态的迁移时间及峰面积相对标准偏差(RSD)小于5%，如表2；相同实验条件下，对透析空白溶液连续测定10次，用峰面积定量，以3倍的标准偏差所对应的含量计算出Mg的检出限分别为32ug·L ；对透析液进行加标，其中游离态镁的回收率为96.0%-103.6%，如表3。 表3血液透析液中游离Mg的加标回收(n=5) 样品 加标量(mg·L) 回收量(mg·L) 回收率(%) RSD(%) Sample01 5.0 4.80 96.0 3.6 Samp le02 5.0 5.18 103.6 3.3 Samp le03 5.0 4.99 99.8 3.8 Samp le04 5.0 5.08 101.6 4.2 3 结论 ( 本文创新性将超声波振荡引入透析系统进行大鼠全血超声透析采样，并与 CE- ICP-AES联用对大鼠血液 ) 透析液中镁元素进行形态分析。在优化实验条件下分析出镁以四种形形存在于大鼠血液透析液中，由峰面积定量透析液中游离镁的含量为 24.2mg·L 。分析结果表明超声波透析速度明显优于平衡透析，该方法比常规透析处理样品速度更快，更适用于生物样品的实时分离分析，为生物样品的快速分离分析提供一种新的分析方法。 ( 参考文献： ) ( [1]傅小芸，吕建德.毛细管电泳[M].杭州：浙江大学出版社，1997：1. ) ( [2]邓延倬，何金兰.高效毛细管电泳[M].北京：科学出版社，1996. ) ( [3] H U YNH B H， FOGARTY B A，MARTN R S， et al On- li n e co u pling ofmicrdialysis samp ling with micro chip -based cap illary electrophoresis[J ] . 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Deparm ent of Chen ical Engineering， Huizhou University， Huizhou 516007， Guangdong China； 2.College of Chen istry and Chen ical Engineering， Guangxi Nom al University， Guilin 541004， Guangxi China) Abstract： The analytical method for speciation ofmagnesium species in rat blood was studied using ultrasonic - assisted dialysis cou-pled with CE- ICP-AESS The op tim izing separation ofmagnesium speciation was achieved by CE - ICP-AES in a 120cm length ×100um intemal diameter fused- silica cap illary， at 18KV separation voltage and a solution of 50mmol· L Tris-HC1 (pH=7. 4) aselectro lyte buffer The foms ofmagnesium in the dialysate of rat blood have four difference species Then the free Mg was identifiedby the spiked and standard species as them have the same migration time The concentration of free magnesium in the dialysate was 24.2 mg·L. RSDs were less than 5%. The recoveries ranged from 96. 0 to 103. 6%. Key words： ultra sonic； m icrodialysis； cap illary electrophoresis； ICP-AES； speciation analysis China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net