大鼠血浆中Mg的形态分析检测方案(毛细管电泳仪)

Vo1.31 No.2Jun.， 2009第31卷第2期2009年6月湖北大学学报(自然科学版)Journal of Hubei University(Natural Science) 158湖北大学学报(自然科学版)第31卷 文章编号：1000-2375(2009)02-0157-04 CE- ICP-AES 用于大鼠血浆中Mg形形态分析 李险峰，孟君，康艳辉：3，邓必阳 (1.惠州学院化学工程系，广东惠州516007；2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；3.河北工程大学医学院，河北邯郸056002；4.广西师范大学化学化工学院，广西桂林541004) 摘要：研究毛细管电泳-电感耦合等离子体原子发射光谱联用技术应用于大鼠血浆中镁元素形态分析的新方法，并对游离态的镁进行表征.实验优化条件为：融熔毛细管120 cm ×100um(I.D.)；缓冲溶液 50 mmol/LNaAc HAc(pH=5.5)；电泳电压20kV.在该条件分析大鼠血浆样品中Mg的形态主要有7种，通过标准Mg的迁移时间及加标后迁移时间定位表征血浆样品中游离镁的形态峰，各形态迁移时间RSD<3%，峰面积定量血浆样品中游离镁的含量为14.0 mg/L，RSD<5%.采用以上联用技术对大鼠血浆样品中游离镁进行了加标回收测定，其加标回收率为95.8%-103.8%. .关键词：电感耦合等离子体原子发射光谱；毛细管电泳；血浆；镁；形态分析 中图分类号：O657.31 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1000-2375.2009.02.013 元素的生物活性及毒性不仅与元素的总量有关，更主要的是与元素的赋存形态有关.在环境和生命体中不同形态的元素表现出不同的生理活性和毒性，不同的元素形态具有不同的化学和生物行为121.镁是人体必需的元素之一，它参与几乎所有生命活动，能维持核酸结构的稳定性，激活体内多种酶，抑制神经的兴奋性，并参与蛋白质合成、肌肉收缩，是细胞新陈代谢中各种酶系统的重要活化剂.镁在蛋白核酸合成和钙通道菲调控中也起重要作用.人体中镁的存在在式有：游离镁、复合镁及蛋白结合镁等.镁是血液和体液的必需组分，分析镁在生物体中的存在形态能更好地了解它们在新陈代谢等生化过程中的作用31.毛细管电泳及联用技术在形态分析中的应用越来越广泛[48].关于血浆、血清的形态分析已有相关研究[3，9]，相关文献对游离态钙镁等元素进行了检测分析[10-14]本文中采用毛细管电泳-电感耦合等离子体原子发射光谱(CapillaryElectrophoresis Inductively CoupledPlasma Atomic EmissionSpectrometry ，简称 CE-ICP-AES)联用技术对大鼠血浆中镁元素的形态进行了分析，在优化实验条件下分析出大鼠血浆中存在7种形态的镁，对大鼠血浆样品中游离态的镁进行了定位，并对样品中各形形的镁进行了定量. 实验部分 1.1 仪器与试剂 Optima 2000DV全谱直读电感耦合等离子体原子发射光谱仪(美国 PerkinElmer 公司)；熔融硅石英毛细管(内径100um、外径375 um，河北永年锐沣色谱公司)；ACS2000 高压电源(北京彩陆科学仪器公司)；自组装毛细管电泳仪和毛细管电泳进样装置；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SYZ-550 石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏勤华玻璃仪器厂) ；pHSJ-4A 实验室pH计(上海精密科学仪器有限公司)；Adventurer 电子分析天平(奥豪斯国际贸易上海有限公司)；TGL-16GA台式高速冷冻离心机(上海仪器厂). CE-ICP 接口参照文献[15]制作.该接口外观类似玻璃同心雾化器，雾化器中心管被毛细管所代替，毛细管出口端处以环氧树脂胶合铂丝作为电极，接口外端口长0.5cm，内径0.5mm，样品出口端为负极. ICP-AES 工作气体为氩气，轴向观测.元素分析线：Mg 279.553 nm.毛细管电 ( 收稿日期：2008-10-06 ) ( 基金项目：国家自然科学基金(20565001)资助 ) ( 作者简介：李险峰(1980- )，男，硕士，助教，Email：wind9425 @163.com ) 泳和 ICP-AES工作条件如表1所示. 表1 毛细管电泳及 ICPAES工作条件 硫酸镁(广州化学试剂厂)；乙酸(广东汕头市西陇化学厂)；乙酸钠(广东汕头市光华化学厂)；37%盐酸(广州化学试剂二厂)；三(羟甲基)胺基甲烷(上海国药集团化学试剂有限公司)；肝素钠注射液(中国江苏万邦生化医药股份有限公司).1000 mg/L标准镁贮备液，50 mmol/L NaAcHAc pH=5.5的 毛细管电泳分离条件 ICP-AES工作条件 缓冲溶液 50 mmol/L RF功率 1 300 W NaAc-HAc pH=5.5 冷却气流速 15L/min 毛细管120 cm X100 umID 辅助气流速0.2L/min 电泳电压 20kV 载气流速 0.8L/min 进样方式0.04MPa X10 s 缓冲溶液，10 mmol/L Tris-HCl pH=7.4的缓冲溶液(均在4℃保存)，使用时逐级稀释至所需浓度.所用试剂均为分析纯，实验用水均为亚沸蒸馏水. 1.2 样品来源及前期处理 大鼠体重约150g，年龄约60天(桂林医学院喂养)，动脉取血.血样直接流入内装抗凝剂肝素钠的离心管中(将配置好的肝素钠均匀地涂布在试管壁上，于60-70℃烘干备用)，.混合均匀后，以4000 r/ min 离心 10 min，取上层清液即为血浆.在4 ℃下保存，实验时用10 mmol/LTris-HCl稀释10倍后用0.45um滤膜过滤，该滤液供分离测定.所有过滤后的样品及溶液均利用超声波振荡 10 min 以除去气泡防止电泳过程中出现电流断流现象. 1.3 样品的引入及电泳分离 新毛细管用0.1 mol/L NaOH冲洗20 min，后用缓冲溶液冲洗30 min.为保证迁移时间的重复性，每次实验进样前，用0.1mol/L NaOH，亚沸水和缓冲溶液依次各冲洗3min.实验时先在毛细管中充满缓冲溶液再以0.04MPa 的氮气压力将样品溶液压入 CE毛细管中，进样完毕后换为缓冲溶液加高压电源20kV 在293K温度下进行电泳分离，然后利用 ICP-AES 来检测形形分离峰. 2 结果与讨论 2.1 缓冲溶液类型、浓度及pH值对分离效率的影响 毛细管分离效率取决于缓冲溶液类型、浓度及pH值，在试验中分别对pH=7.4和pH=5.5的 TrisHCl，NaAc- HAc进行考察，结果表明：pH=5.5的NaAc- HAc 缓冲液有利于血浆样品中镁元素形态的分离.同时采用10，20，30，50和80 mmol/L pH=5.5的 NaAc- HAc 进行电泳分离，随着浓度增加，不同形态峰分离效果明显，但浓度过大时电泳电流较大产生焦耳热不利于生物样品分析.故本实验采用50 mmol/L pH=5.5的 NaAc-HAc 作为电泳缓冲溶液. 2.2 电泳电压对出峰时间和分离效率的影响 在50mmol/LpH=5.5的 NaAc-HAc 作为电泳缓冲溶液时考察了电泳电压范围16-25kV对分离效率及出峰时间的影响.随着电压的增加迁移流出时间缩短不利有效分离样品，况且电泳电流也会随之增加焦耳热效应明显.综合以上因素选择20kV为电泳电压，在此条件下，样品中Mg的7种形态能在12 min 内很好分离开，分离效果较优. 2.3 大鼠血浆样品中镁的形态分析及游离态镁的表征 血浆样品以10 mmol/L Tris HCl稀释10倍后用0.45 um 滤膜过滤，采用最佳实验条件(如表1)，对大鼠血浆中镁的形态进行分析，结果如图1所示.由于 ICP-AES 元素分析线Mg 279.553nm 的选择性，从图1中可以看出：Mg在大鼠血浆中主要以7种化学形态存在，分别用Mg1 至Mg7表示在图上，各形态的迁移时间如表3所示. 为表征游离态镁的形态峰，相同大鼠血浆样品中加入5mg/LMg标准溶液后在相同条件下电泳时的形态分析如图2 图1 大鼠血浆样品中Mg的形态分析 所示，在图2中，Mg8处其迁移时间为655s，其峰高明显增大，而其他位置的形态峰的强度几乎无变化.从电泳分离图3可以看出：浓度为5mg/L标准镁的迁移时间为652.5s，即游离态镁的迁移时间.从迁移时间来看，Mg6的迁移时间为650s，游离态镁的迁移时间为652.5s，而加入标准镁之后在655s处的形态峰峰高显著增高，三者形态峰迁移时间非常吻合，依此可以判断Mg6 为游离态的镁. 对于其他6种峰具体为何种形态的镁，有待于其他复合镁或蛋白结合态镁的标准的分析，或采用质谱及其联用技术可以具体分析其存在的形态或结构. 图2 大鼠血浆样品加标后Mg的形态分析 图3 标准游离Mg的形态分析(5 mg/L) 2.4 CE ICPAES联用技术检测血浆精密度及检出限 在最佳实验条件下，以0.04 MPa 氮气压力进 样10s，对血浆样品电泳测定10次，各形态的峰面积相对标准偏差 RSD<5%见表3.相同实验条件下，对空白溶液(肝素钠和 Tris-HCl 溶液)连续测定10次，用峰面积定量，以3倍的标准偏差所对应的含量计算出Mg的检出检为18 pg/L. 2.5 加标回收试验 分别在4个血浆样品中加入5 mg/L Mg进行加标回收检测，采用峰面积对游离态的镁定量回收，其加标回收率为95.8%-103.8%.检测结果如表2所所. 表2 血浆样品中游游Mg的加标回收(n=5) Samples Added/(mg ·L) Recovered/(mg ·L) Recovery/% RSD/% Plasma01 5.0 4.83 96.6 3.3 Plasma02 5.0 5.19 103.8 4.8 Plasma03 5.0 4.79 95.8 3.6 Plasma04 5.0 5.13 102.6 4.7 2.6 血浆样品中游离态镁的定量及其他形态镁的估算 利用CE-ICP-AES联用技术对大鼠血浆样品中的Mg进行了形态分析，从分离形态峰来看，血浆样品中Mg主要以7种形态存在.由峰面积来计算游离镁含量及估算其它形态镁的含量如表3所示，其中游离态镁的含量为14.0 mg/L. 表3 血浆样品中 Mg的形态分析及定量(n=10) Speciation Migration time/s RSD/% Concentration/(mg ·L) RSD/% Mg0 652.5 2.7 5.0 4.1 Mg1 450.0 2.4 11.9 3.6 Mg2 472.5 1.9 8.9 4.0 Mg3 540.0 2.6 4.0 2.7 Mg4 557.5 1.6 7.1 3.2 Mg5 617.5 2.9 5.1 3.7 Mg6 650.0 2.6 14.0 2.1 Mg7 667.5 2.3 12.8 3.9 3 结论 采用毛细管电泳-电感耦合等离子体原子发射光谱(CE-ICP-AES)联用技术对大鼠血浆中的镁元素形态进行了初步探讨分析，并且对游离态的镁进行了定位表征与定量分析.在实验优化条件牛测得血浆样品中游离镁含量为14.0 mg/L.对游离Mg的形态进行表征有重要生物化学及生理意义.本实验为生物样品中游离金属离子含量的测定提供了一种方便快捷，行之有效的方法. 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Baseline separation ofmagnesium speciation was achieved by using fused- silica capillary， a 20 kV separation voltage and asolution of 50 mmol/L NaAc-HAc (pH=5.5) as electrolyte buffer. CE-ICP-AES analysis of a ratplasma sample showed the presence of seven magnesium species， one of which was identified as freeMgion. The concentration of free magnesium in the plasma was 14.0 mg/L. RSD of migration timeand peak areas were less than 5 %. The recoveries of the free magnesium species in four samplesranged from 95.8 to 103.8%. Key words：ICP-AES； capillary electrophoresis； plasma； magnesium； speciation analysis ( (责任编辑 胡小洋) ) OChina Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved http：//www.cnki.net