尸体脏器中硅藻种类检测方案(微波消解)

中国法医学杂志 CHNJ FORENSICMED 2010年第25卷第3期 微波消解-扫描电镜联用检测脏器内硅藻 胡孙林.'，温锦锋，张小婷，方 走超，王松才，戴维列，刘 超 (1.广州市刑事科学技术研究所，广州45510030；2.中山大学医学院法医系，广州510080) 摘要】目的 介绍一种微波消解扫描电镜联用检测脏器内硅藻的新方法。方法 大白兔 30只，随机分为生前溺死组(n=15)和死后溺尸组(n=15)。提取兔肺、肝、肾、股骨骨髓和现场珠江水样，采用建立的微波消解扫描电镜联用法检测脏器组织和水样中的硅藻，并与硝酸乙醇消解扫描电镜联用的方法进行比较。结果 生前溺死组的兔兔、肝、肾、股骨骨髓组织中大多数观测到与现场珠江水样一致的硅藻，微波消解扫描电镜联用法检测脏器内硅藻的平均含量分别为：2505.2个/2g肺，18.7个/10g肝，6.5个/10g肾，6.3个/0.5g骨髓；肺与肝、肾、骨髓检出硅藻的阳性比例为86. 7%，脏器硅藻检出含量和硅藻检验阳性比例均明显高于硝酸乙醇消解扫描电镜联用法所测值。死后溺尸组的兔脏器组织均未观测到硅藻。结论 微波消解扫描电镜联用法检测脏器内硅藻，高效、安全、环保，硅藻检验灵敏度高，降低了劳动强度，提高了定性定量分析准确度，且能有效避免污染，在法医学溺死鉴定中具有良好的应用价值。 关键词】法医病理学；溺死；微波消解；扫描电镜(SEM)；硅藻检验 文献标识码】A 文章编号】1001-5728(2010)03-0145-05 Using m icrowave digestion techn ique and scann ing electron m icroscopy to detect dia toms in organs for the dagnosis of drown ng (HU Sunlin， WEN Jinfeng， ZHANG Xiaoting， FANG Chao， WANG Songcai，DA IWeilie， LIU Chao /1. Guangzhou Forensic Science Institute， Guangzhou 510030， China； 2 Deparm entof Forensic Science， Zhongshan School ofM edicine， Sun Yat sen University， Guangzhou 510080， China) Abstract】 O bjectives To present a novel method using microwave digestion technique and scanningelectron m icro scopy (SEM) for diatom test in medicolegal diagnosis of drowning M ethods 30 white rabbitswere divided randomly into to groups， i e， drowning gioup (n=15) and postmortem immersion group.Lungs and closed organs (liver， kidney and femoral marrow) of the rabbits as well as the drowning mediumwere collected for diatom analysis with the established method using microwave digestion and SEM. And forthe puipo se of comparison， the method using conventional chem ical digestion (nitric acid and ethanol diges-tion) and SEM was also used Results For the drowning gioup： diatoms with a concordance of types wererecovered in most organs and water‘The average diatom concentrations in organs detemm ined by the methodusing microwave digestion and SEM were 2505. 2/2g of lung， 18. 7/10g of liver， 6. 5 /10g of kidney and6. 3 /0. 5g of bone marrow respectively and the ratio of positive diatom test with diatom present in lungs andclosed organs was 86. 7%， which were all significantly higher than the values detemm ined by the method usingconventional chem ical digestion and SEM. FFor the postmortem mmersion group， no diatom was detected inthe organs by the both methods Conclusion The developed novelmethod using m icrowave digestion and SEMis high-efficiency， safe， environment-friendly， labor-saving， sensitive， accurate and contam ination-free forqualitative and quantitative diatom analysis， thus is of prom inent application value in forensic diagnosis ofdrowning Key words】 forensic pathology， diagnosis of drowning； microwave digestion； scanning electron micioscopy； diatom test ( 基金项目】广州市科委科技攻关项目资助(2007Z1-E0061) ) ( 作者简介】胡孙林，男，博士，主要从事微量物证检验和法医 ) ( 物证学检验。Email ： sunli n hu@ yahoo co m . c n ) 靠的溺死诊断手段，尤其对于水中腐败尸体的死因鉴定，被视为最佳的鉴定方法。文献报道硅藻检验方法有很多，其中采用硝酸和乙醇(或乙醚)的强酸化学消解法具有组织消解时间短、消解完全、程序简单、成本低等优点，是目前我国实际 检案中的一种标准化方法。但该法在消解组织过程中，有部分硅藻被破坏，存在硝酸喷出灼伤人体的危险，所释放的二氧化氮污染环境。1993年，Acker等4]在硅藻分类学研究中’，采用微波消解技术消解水中硅藻的有机质，认为与用传统电热板加热的硝酸消解法相比，该法更安全、方便，有机质消解更彻底，且因强酸使用量少而更加环保。2002年，孙维琦等探索性地采用微波消解技术对5例溺死尸体肺组织内硅藻进行提取，结果表明微波消解所需组织少、消解时间短、硅藻检出率高。为此，本文建立了一种微波消解扫描电镜联用的硅藻检验方法，并与硝酸乙醇消解扫描电镜联用法进行比较，现报道如下。 材料与方法 1.I 实验材料和设备 1. 1. 1 动物及其分组 30只新西兰大白兔(广东省动物实验中心提供)，雌雄不限，体重1.0~3.0kg，随机分生前溺死组和死后溺尸组，每组15只。 1. 1.2 实验设备 MW3000微波消解仪，含8位超高压消解罐(An-ton Parr公司)；自行设计的真空抽滤装置(照片1)；Quanta 600型扫描电镜(FEI公司)，配 Genesis7000型能谱仪(EDAX公司)。 照片1真空抽滤装置 1：100mL滤杯；2：尼龙滤膜(直径 25mm，孔径 0.45um)；3：抽滤接口(抽滤区域直径为 9mm)； 4： 1000mL滤液收集瓶；5：橡胶管； 6：旋转机械泵 Photo 1 Vacuum filtration device 1：100mL filtra-tion cup；2： nylon filtration membrane (diameter 25mm，pore size 0. 45pm)； 3： connection adap ter(filtration di-ameter： 9mm)； 4： 1000mL conical flask for collection ofwaste liquid； 5： rubber tube； 6： rotary pump 1.2 动物死亡模型及其检材提取 将生前溺死组兔置兔笼中，沉入珠江水下0.5m后1min提出水面30s后重新沉入相同水深处，重复3、4次使大白兔缓慢溺死，死后在水中浸泡 30m in；死后溺尸组兔采用空气栓塞法处死后，置于相同水域同样深度浸泡 30min后取出。提取兔肺、肝、肾、股骨骨髓组织以及现场珠江水样，分别采用微波消解扫描电镜联用法和硝酸乙醇消解扫描电镜联用法检验硅藻。检验前确认所有试剂、工具、器皿以及消解罐不含硅藻，并通过空白对照试验避免污染。 1.3 兔脏器组织和现场水样中的硅藻检验方法 1.3.]1 微波消解扫描电镜联用法 微波消解 取肺组织2g，肝、肾组织各10g，股骨骨髓0.5g以及2mL现场水样，分别置消解罐内，加入8mL浓硝酸和 2mL 30%双氧水后分别进行微波消解。微波条件设置：5min内将微波功率由0升至800W，保持10min后停止微波辐射，以强风冷却方式使消解罐外部温度降至50℃。然后于消解罐内加入40mL超纯水以释释组织消解液的酸度。每批次消解8个样品，每个消解罐内组织样品不超过2.5g，肝、肾组织分别等分成5份(因压力所限，微波消解时对每个消解罐的样品量有限制)后消解，消解后合并消解液。消解罐使用后用2mol/L的 NaOH浸泡过夜，以溶解可能残留的硅藻。 真空抽滤 将消解液倒入滤杯内抽滤后(真空度200mmHg)，加 50mL超纯水使滤膜表面接近中性，再加10mL乙醇去除滤膜内水分。取出滤膜，剪取滤膜与消解液接触部分，真空喷镀金膜后用扫描电镜分析。 扫描电镜分析 扫描电镜参数：加速电压 20kV，放大600倍，图像分辨率1024×800，设定将所剪取滤膜包含在内的约10mm X10mm的矩形区域为扫描范围(图11)，分成21 ×27个相邻视场，每个视场为0.472mm X0. 368mm，每个视场图像采集时间为10s. 图1 600倍条件下扫描电镜自动扫描时的视场分布图 Fig1 Field d istr ibution map for automa ted scanningwith the magn ifica tion of 600X under SEM 调好焦距后，系统自动扫描、逐个拍摄并存储每个视场照片，根据照片结果进行硅藻定性定量分析，并通过回访感兴趣视场，在高倍下拍摄硅藻高分辨扫描电镜照片，硅藻尺寸可通过仪器自带的 XTDocu分析软件进行准确测量。 1.3.2 硝酸乙醇消解扫描电镜联用法 参考文献[2]采用硝酸乙醇法对实验兔肺2g肝10g肾组织10g股骨骨髓 0.5g和2mL现场水样进行消解，消解液2500r/m in离心 25m in，弃掉上层液，加入超纯水，重复该过程3次，最后3000r/min离心，弃掉上层液，取沉淀液置扫描电镜铝样品座上，烘干镀金膜 后，用扫描电镜按上述方法设置参数后自动分析。 1.4统计学处理 应用 SPSS 13.0统计学软件对实验数据进行方差分析等统计学处理，P<0.05为有显著性差异。 2 结 果 2.1 现场水样及兔各脏器组织的硅藻定量 采用微波消解扫描电镜联用法和硝酸乙醇消解-扫描电镜联用法，检测现场水样的硅藻数分别为2952个/mL水和2327个/mL水。生前溺死组兔各脏器组织中的硅藻检验及其数据统计见表1. 表1 生前溺死组兔脏器内硅藻含量(个数/组织重量)与统计结果 Table 1 D a tom concen tra tions in organs of the drown ing group (num ber of dia tom per weight) and the statistical result 编号 肺(2g) 肝(10g) 肾(10g) 股骨骨髓(0.5g) A B A B A B A B 1 4100 3481 30 18 5 3 10 6 2 3650 3003 35 21 15 11 0 0 3 1236 1051 3 0 0 0 5 0 4 2178 1951 20 16 12 7 12 4 5 3652 3104 12 9 0 0 3 1 6 3109 2343 25 21 13 10 0 0 7 3724 3169 19 13 6 4 6 3 8 2638 2042 23 17 8 0 15 8 9 1224 1140 17 17 12 3 7 5 10 750 538 0 0 0 0 0 0 11 1375 1269 32 26 12 6 13 7 12 1945 1453 5 0 0 3 0 13 4238 3902 45 36 15 12 21 11 14 506 410 0 0 0 0 0 15 3253 2665 15 0 0 0 0 x+s 2505.2+127132101 4+11004187+134 129±11.2 65+62 3.7±44 63+66 3.0±3.7 ×100% 19% 45% 76% 110% A：微波消解扫描电镜联用法；B：硝酸乙醇消解扫描电镜联用法 2.2 现场水样及兔各脏器组织中的硅藻 SEM观察 现场水样中观察到含有直链藻、小环藻、辐环藻、菱形藻、舟形藻，以及针杆藻、曲壳藻、布纹藻、冠盘藻、卵形藻海链藻、菱板藻等，硅藻大小7um~1mm 不等。 溺死兔肺组织中含有现场水样中的大多数种类 硅藻，如直链藻、小环藻、辐环藻、舟形藻、菱形藻、曲壳藻等，硅藻大小多为10~20pm，极少超过80um肝、肾、股骨骨髓组织中所见硅藻种类很少(1~3种)，如小环藻、舟形藻、曲壳藻，硅藻大小约7~30um(照片2) m8088. (a) (b) (c) (d) (e) (f) 照片22溺死实验验脏器组织内的常见硅藻(SEM) (a)直链藻8000×(b)小环藻8000×(c)辐环藻6000×(d)舟形藻10000 ×(e)菱形藻5000X；(f)曲壳藻15000× Photo 2 Species of the dia tom s frequen tly detected in the organs in the drown ing group(SEM) (a)Melosiragranulata 8000 x； (b) Cyclotella 8000 x (c)Actinocyclus 6000 x； (d)Navicula 10000 × (e) Nitzschia 5000 x；(f) Achnanthidium 15000 × 微波消解扫描电镜联用法和硝酸乙醇消解扫描电镜联用法，均未从死后溺尸组兔肺、肝、肾及骨髓组织中检测出硅藻。 3 案例应用 例1 2006年12月16日，一名3岁女童失踪。3个月后，在一住宅小区的蓄水池中发现女童尸体，已高度腐败。提取尸体肺、肝、肾进行硅藻检验。采用硝酸乙醇消解扫描电镜联用法检验，肺中检出与蓄水池中相同类型的硅藻，含量为550个/10g肺组织，未检出肝、肾组织中的硅藻；采用微波消解扫描电镜联用法检验，肺、肝、肾组织中均检出与蓄水池水样中相同类型的硅藻，含量分别为720个/10g组织、3个/10g组织、2个/10g组织。根据尸体肺、肝、肾中均检出与现场水样相同种类硅藻的结果，判定死因为溺死。经调查证实，该女童为意外落水溺死。 例2 2009年2月13日，黄某(男，38岁)被绑架失踪，10日后在郊区一湖里发现尸体，已高度腐败。尸体解剖后取肺、肝和肾组织进行硅藻检验。采用硝酸乙醇消解扫描电镜联用法检验，仅在肺中检出与现场水样相同类型的硅藻，含量为2030个/10g组织，肝、肾组织未检出硅藻；采用微波消解扫描电镜联用法检验，肺、肝组织中均检出与 现场水样相同类型的硅藻，其中肺组织中硅藻含量为2580个/10g组织，肝组织中硅藻含量为5个/10g组织，肾组织未检出硅藻。根据肺、肝组织中均检出与现场水样相同种类的硅藻的检验结果，诊断死因为溺死。破案后证实犯罪嫌疑人将事主绑架后，因害怕事主反抗及其家属报案，于当晚将事主装入铁笼后抛入湖里致其溺死。 4 讨 论 本文首次采用微波消解和扫描电镜联用检测脏器内硅藻，其优势表现在以下方面。 4.1 高效、安全环保 微波消解技术是近几年来发展起来的一种先进、高效的样品消解技术，研究表明161，对于相同脏器组织，采用微波消解所需时间约为硝酸乙醇消解法的1/5，强酸消耗量大大减少且在密闭环境下进行消解，因而更安全、环保。在本研究微波消解扫描电镜联用的实验过程中证实，尽管消解罐被反复使用，但只要操作得当，并做好空白对照试验，就能有效防止污染。 4.2 提高硅藻提取回收率 目前认为，仅从水中尸体肺脏检出硅藻难以作出溺死的确定诊断，在严格控制污染后，必须在肺及 封闭器官(肝、肾、骨髓等)中同时检出硅藻且硅藻种类与现场水样中的硅藻种类一致(即硅藻检验阳性)，才能鉴定为溺死。因此，提高脏器尤其是封闭器官中硅藻的提取回收率，对法医学溺死诊断具有重要的现实意义。 本实验采用硝酸过氧化氢消解体系，摸索建立了合适的微波消解参数。扫描电镜观察结果表明，在所采用的消解体系和微波消解参数条件下，硅藻结构完整，残骸碎片极少，表明硅藻破坏程度较小。有研究证实6目前硅藻检验方法中所采用的离心处理步骤导致了部分硅藻损失。自然界的硅藻最小尺寸约3m，本文采用0.45um的微孔滤膜，通过真空抽滤提取组织消解液中的硅藻，可最大程度避免硅藻损失，提高硅藻提取的回收率。本文实验结果表明，对于各脏器组织中硅藻的提取，与硝酸乙醇消解离心的提取方法相比，采用微波消解真空抽滤方法提取，平均回收率均有显著增加，其中肺增加19%，肝增加45%，肾增加76%，骨髓增加110%(表1)，另一方面，采用微波消解真空抽滤提取方法的硅藻检验阳性比例更高。溺死组的15例中，13例肺及肝、肾、骨髓组织中均检检硅藻(86.7%)；而采用硝酸乙醇消解离心提取法，硅藻检验阳性只有10例(66.7%)；因此，微波消解真空抽滤的硅藻提取方法可提高确定溺死诊断的比例。本实验2起案例进一步证明这一点，采用硝酸乙醇消解离心提取法无法作出确定溺死诊断的水中高度腐败尸体，通过微波消解真空抽滤的硅藻提取法死因得以明确。 4.3 提高硅藻定性定量分析的准确度 目前国内外法医学实验室大多采用光镜检测硅藻。然而，进入溺死尸体肝、肾、骨髓等脏器组织的硅藻一般个体小，含量低，如 Pollanen等的研究表明溺死尸体骨髓内硅硅小于30um，数量小于10个，采用光镜检测这些微型硅藻时，受放大倍数所限，分析误差难以避免，可能是导致硅藻检验备受争议的原因之一[10]。本文首次采用扫描电镜自动扫描分析，避免了光镜检测中逐个视野进行聚焦、观察的人工硅藻检测方式，大大降低了劳动强度，而且根据高分辨硅藻扫描电镜照片进行硅藻种属认定，提高了硅藻定性定量分析的准确度。 4.4 可用于建立各地区水样和水中尸体脏器内硅藻数据库 硅藻对水质敏感，是江河湖海水质检测的重要指标。不同水域水质不同可能导致硅藻种群分布有差异。Ludes等报道了法国江河与溺死尸体中的硅藻存在明显关联，指出对经常发生溺死事件的水 域进行监测，建立硅藻数据库，有助于根据脏器内硅藻检验结果推断溺死地点。目前，通过监测水质建立硅藻数据库，在国外开展较多，我国尚处起步阶段。微波消解扫描电镜联用法高效、硅藻定性定量分析准确，因此可被有效用于建立各地区水样的硅藻数据库，同时亦可用于建立各水域水中尸体脏器内的硅藻数据库，从而为溺死诊断和溺死地点推断提供依据。 综上所述，微波消解扫描电镜联用法检测脏器内硅藻，高效、安全、环保，硅藻检验灵敏度高，降低了劳动强度，提高了定性定量分析准确度，且能有效避免污染，因此在法医学溺死诊断中具有良好的应用前景。 ( (暨南大学水生生物研究所胡韧博士在硅藻种属鉴定给予的帮助，在此致谢!) ) ( 参 考 文 献 ) ( [ 1] P i etteM H， De Letter E A. D r o wning： Sti l l a difficult autop-sy diagnosis[J ]. F orensic Sci I n t， 2006，16 3 ：1-9 . ) ( [2]中华人民共和国公安部. GA/T813-2008人体组织器官 中硅藻硝酸破机法检验[S].北京：中国标准出版 社，2009. ) ( [3]王恩银，孟祥志.4种硅藻检验方法的比较研究[J]. 国法医学杂志，2005，20(5)：274-277. ) ( [4] Acker FW， W alterD M， RobertsN A， et al M icrowave di- gestion of diatom samp les[ R ]. T he 1 2 th North American D ia - tom Symposium， D elta Marsh， Manitoba， C anada 23-25 Sep tember 1993. ) ( [5]孙维琦，于晓军，李坦.微波消解法检验硅藻的实验研究 [J].法医学杂志，2002，18(3)：175-176. ) ( [6]胡孙林.两种微束分析在法医学溺死诊断中的应用研究 [D].中山大学博士学位论文，2009：27 - 49. ) ( [7]祝家镇.法医病理学[M]第2版.北京：人民卫生出版 社，2 0 02：2 6 5-266. ) ( [8] P achar J V， Cameion J M. The D iagnosis o f drowning by quantitativ e and qualitativ e diatom analysis [J ]. Med SciLaw， 1993， 3 3(4)：291-299. ) ( [9] P ollanen M S ， C heung C， C h iasson D A. T he diagnostic val- ue of the d iatom t e st for drowning， I U tility. a r etro spective analysis of 771 cases of drowning in Ontario， Canada [ J ] .J Forensic Sci， 1997 ， 42：281-285. ) ( [ 1 0] H itlimann J， Feer P， E l ber F ， e t a l D iatom d e tection in the diagnosis of death by drowning[J]. I ntJ LegalMed，2000， 114： 6-14 ) ( [ 1 1] L udes B， C osteM ， Tr a cquiA， et al Co n tivuous river mo- nitoring of diatoms in the diagnosis of drowning[J ] . J F o- rensic Sci， 1996， 41(3)：425-428. ) ( (收稿日期：2009-03-30) ) ·@China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net