血液中28种常见毒物检测方案(气质联用仪)

Excellence in Science 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 在线凝胶色谱净化结合三重四极杆气质联用仪在公安系统日常毒物排查中的应用 GCMSMS-092 摘要：在线凝胶色谱净化系统(GPC)可以有效去除样品中的蛋白质、脂肪及色素等大分子物质，缩短样品前处理时间；同时将净化后的样品大体积导入至 GC-MS/MS， 并结合全扫描 (SCAN)和多反应监测(MRM) 同时采集的方式进行分析， MRM可有效去除基质干扰，对重点监测物质进行排查；而 SCAN 可以直接用于 AMDIS 检索，对其他物质进行补充排查。本文采用岛津公司的 GPC-GC-MS/MS 系统， 在无需标准品同时不分时间段进行采集的情况下，建立了筛查血液样品中166种常见毒物、农药及镇定剂类等物质的方法。血液样品经简单前处理后，分别添加26种日常毒物混标，采用所建立的 MRM+Q3 SCAN 同时采集的方法对目标组分进行灵敏度考察。在 10 ug/L 浓度下，血液样品中的26种常见毒物均被筛查出来，且组分相应信号高，同时利用 AMDIS 对采集的 Scan数据进行分析，可以防止在司法鉴定中的漏检现象。该方法简单易操作、灵敏度高，完全满足公安系统日常毒物排查的检测要求。 关键词：在线凝胶色谱 (GPC) 三重四级杆气质联用仪(GC-MS/MS)毒物排查公安系统 AMDIS 血液 GPC 凝胶色谱是基于目标物分子大小的一项分离技术，广泛用于残留分析中样品的净化。在生物检材尤其是腐败生物检材的日常毒物排查当中，血、肝、胃等组织的提取液中含有大量的油脂、色素等物质，对后续分析工作产生很大的干扰。目前，文献报道的净化方法通常有柱净化法、反提法、固相萃取净化法等，操作程序复杂、自动化程度不高，重现性、精密度等完全依赖操作人员的水平，对分析人员的要求较高。GPC 凝胶色谱可有效去除生物样品中的大分子干扰物，但离线的 GPC凝胶色谱需使用大量的有机溶剂洗脱后在进行浓缩，耗时较长，在线 GPC 净系系统即可以净化样品，同时也能将净化的样品大体积进入到气质系统进行分析，自动化程度更高，更有利于日常生物样品的分析。 气相色谱质谱联用仪(GC-MS)因其可以将采集到的样品全扫描色谱图(SCAN)直接导入解卷积软件(AMDIS)，有效去除化合物共流出问题，而成为公安系统普遍使用的分析仪器。但对于生物检材如：血液、肝 脏等，因其存在大量干扰物，需要复杂的样品前处理，且即使采用选择离子扫描(SIM)的方式也无法去除样品干扰，使得目标化合物被掩盖在基质中，无法准确定性定量，给日常毒物排查工作带来困难。而三重四极杆气质联用仪(GC-MS/MS)其独有的多反应监测模式(MRM)可以有效去除生物基质干扰，有利于日常毒物排查的定性定量工作。同时，因日常维护仪器时，色谱柱切割导致目标化合物保留时间偏移，在采集样品的过程中，会导致有些目标化合物因偏差过大而无法采集到，导致在日常检测过程中的漏检发生。 本文以血液中常见的有毒物质为例，介绍了在线GPC-GC-MS/MS 系统在公安系统日常毒物排查中的应用。使用此系统，，可以有效减少样品前处理过程，同时减少基质干扰对目标物质的干扰，有利于公安系统日常毒物排查的效率，为司法鉴定及刑事案件的侦查等提供快速、可靠的检测依据。 实验部分 1.1仪器 PTV 进样口温度程序：120℃(5min) 100℃ /min 岛津在线凝胶色谱串联三重四极杆气质联用仪(GPC-GC-MS/MS) 11.2分析条件 GPC条件： 250℃(25.7 min)进样口压力程序：120 kPa(0 min)_100kPa/min _180kPa(4.4 min)_(-49.7 kPa/min)_120 kPa(25.79 min)隔垫吹扫程序： 5.0mL/min_(-10 mL/min)_0 mL/ 色谱柱： ShodexCLNpak EV-200(2mmx150 mm) min(6 min)_10 mL/min_5 mL/min (25 min) 流动相：丙酮/环己烷(3/7， V/V) 不分流进样时间：7 min； 流速：0.1mL/min 溶剂切割时间：9min 柱温：40℃ 接口温度：280℃；离子源温度：250℃ 进样量：10uL 采集方式： MRM，采集条件见表1 GC-MS/MS 条件： 采集模式： Q3 Scan+MRM， 色谱柱：惰性石英管：5mx0.53 mm MRM采集参数见表1 预页： DB-5MS， 5 mx0.25 mmx0.25 um Q3 Scan 采集范围：90~500 amu 分析： DB-5 MS， 25 mx0.25 mmx0.25 um 检测器电压：调谐电压 +0.4 kV 柱温程序：82℃(5min)_8℃/ min_120℃(0min)_15℃ /min_300(10.25min) 1.3样品前处理 移取1mL血液样品于固相支撑液液萃取柱(SLE)上，静至5 min后，利用4mL乙酸乙酯：二氯甲烷=1：1(v/v)进行洗脱。对于实际检材可直接上 GPC-GC-MS/MS 分析进行毒物筛查，本文利用空白血液洗脱液配制含有28种常见毒物样品模拟实际检材，利用所建立方法进行筛查。 表1166种日常毒物组分名称、CAS号及MRM参数 No. 化合物名称 CAS 定量离子对 CE 定性离子对 CE 1 Valproic acid 99-66-1 102.0>73.0 6 102.0>55.0 21 2 Phentermine 122-09-8 134.0>117.0 9 134.0>115.0 15 3 Bromisovalum artifact 0-00-0 139.0>122.0 15 137.0>120.0 18 4 Methamidophos 10265-92-6 141.0>95.0 8 95.0>64.0 12 5 Dichlorvos 62-73-7 185.0>93.0 14 145.0>109.0 12 6 Ethosuximide 77-67-8 113.0>69.0 15 113.0>41.0 27 7 Propofol 2078-54-8 178.1>163.1 12 163.1>117.1 15 8 Acephate 30560-19-1 136.0>94.0 14 142.0>96.0 9 9 Metolcarb 1129-41-5 108.0>77.0 24 108.0>90.0 12 10 Ecgoninemethylester 106293-60-1 96.0>81.0 18 82.0>55.0 15 11 Apronalide 528-92-7 141.0>81.0 6 142.0>82.0 6 12 Barbital 57-44-3 156.0>141.0 9 156.0>98.0 18 13 0xamyl 23135-22-0 162.1>115.1 9 145.1>72.0 21 14 Isoprocarb 2631-40-5 136.0>121.0 10 121.0>77.0 18 15 XMC 2655-14-3 122.0>107.0 14 122.0>77.0 26 16 Xylylcarb 2425-10-7 122.0>107.0 14 122.0>77.0 24 149 Tofisopam 22345-47-7 326.1>310.1 27 341.1>310.1 24 150 Etizolam 40054-69-1 342.0>272.0 21 342.0>245.0 27 151 Triazolam 28911-01-5 313.0>277.0 24 313.0>242.0 33 152 Brotizolam 57801-81-7 245.0>165.0 24 394.0>313.0 9 153 Thioridazine 50-52-2 370.1>98.1 18 370.1>126.1 12 154 Noscapine 128-62-1 220.1>205.1 18 220.1>147.1 27 155 7-Acetamidoclonazepam 41993-30-0 327.1>299.1 9 299.1>222.1 21 156 LSD 50-37-3 323.1>222.1 15 221.1>206.1 18 157 JWH018 209414-07-3 284.1>167.1 18 341.1>167.1 27 158 Yohimbine 146-48-5 353.1>197.1 24 353.1>321.1 21 159 Quetiapine 111974-69-7 239.1>210.1 12 210.1>183.0 15 160 Pericyazine 2622-26-6 114.0>44.0 12 365.1>142.0 12 161 M-II (Estazolammnetabolite) 0-00-0 275.1>221.1 15 310.1>275.1 9 162 Trazodone 19794-93-5 205.1>176.1 12 278.1>194.1 12 163 Spiperone 749-02-0 244.1>42.0 27 377.1>203.1 15 164 Tadalafil 171596-29-5 262.1>204.1 27 389.1>262.1 27 165 Sildenafil 0-00-0 99.0>56.0 9 404.1>312.1 21 166 Vardenafil 224785-90-4 113.0>70.0 12 113.0>98.0 12 结果讨论 2.1 MRM 方法建立及数据处理参数设置 将上述166个化合物的定量及定性离子对输入到方法编辑界面下，同时在整个采集过程中不分时间段，全部采集这332个离子对，以保证在维护仪器的过程中，即使进行色谱柱切割，也不会导致因目标化合物保留时间的变化而无法采集到目标组分。图1为在方法编辑界面下的建立的166个化合物不分时间段采集 MRM+Q3 Scan 方法。 因不设置166种化合物的保留时间，因此，在数据处理的过程中，在化合物表中输入每个化合物的时间为20min(如图2所示)，同时峰处理时间窗口加大，以保证化合物在整个采集时间内进行搜索(如图3所示，峰处理时间设置为10 min， 以保证化合物在采集的时间段内进行分析)，同时最大的峰积分个数设置为1，以保证在峰处理时间段内快速的进行化合物的寻找。 图1不分时间段采集的MRM+Q3 Scan方法界面 GCMSMS-092 编 ID# 名称 类型 ISTD组 m/z 保留时间 保留指数 单位 参考离子 浓度1 浓度2 1 Valproic aci 目标 1 102.0073.00 20.000 0 102.0055.00 1 1 2 Phentermin 目标 1 134.00-117.00 20.000 0 134.00115.00 1 1 3 Bromisoval 目标 1 139.00>122.00 20.000 0 137.00>120.00 1 1 4 Methamido 目标 1 141.00=95.00 20.000 0 95.0064.00 1 1 5 Dichlorvos 目标 1 185.00=93.00 20.000 0 145.00>109.00 1 1 6 Ethosuximi 目标 1 113.00>69.00 20.000 0 113.00>41.00 1 1 7 Propofol 目标 1 178.10163.10 20.000 0 163.10>117.10 1 1 8 Acephate 目标 1 136.0094.00 20.000 0 142.00-96.00 1 1 9 Metolcarb 目标 1 108.00=77.00 20.000 0 108.0090.00 1 1 10 Ecgoninem 目标 1 96.00=81.00 20.000 0 82.0055.00 1 1 11 Apronalide 目标 1 141.0081.00 20.000 0 142.0082.00 1 1 12 Barbital 目标 1 156.00141.00 20.000 0 156.00-98.00 1 1 13 Oxamyl 目标 1 162.10>115.10 20.000 0 145.10-72.00 1 1 14 Isoprocarb 目标 1 136.00=121.00 20.000 0 121.00>77.00 1 1 15 XMC 目标 1 122.00-107.00 20.000 0 122.0077.00 1 1 16 Xylylcarb 目标 1 122.00-107.00 20.000 0 122.0077.00 1 1 17 Ethenzami 目标 1 150.10-133.10 20.000 0 150.1077.00 1 1 18 Fenobucar 目标 1 150.10-121.10 20.000 0 121.00-93.00 1 1 19 Propoxur 目标 1 152.00>110.00 20.000 0 110.00>64.00 1 1 20 Allobarbital 目标 1 167.00124.00 20.000 0 167.00=106.00 1 1 21 Bendiocarb 目标 1 166.10151.10 20.000 0 166.10=126.10 1 1 22 Acetamino 目标 1 151.00>109.00 20.000 0 109.0080.00 1 1 22 17010100n 2ngnn 0 170 10s137 10 1 图2数据处理时化合物表设置界面 图3数据处理界面参数设置 2.2基质加标溶液筛查结果 空白血液样品按照样品前处理过程处理好后，使样品中加标浓度为10、50、100ug/L，作为筛查样品，对其方法的灵敏度进行考察。由于篇幅所限，图4列举了部分筛查出化合物的质量色谱图，表2给出了各化合物的信噪比。 (x10，000) 图44 .血液基质加标溶液(10ug/L)中部分目标组分的质量色谱图 表2基质加标溶液中筛查出26种常见毒物的峰面积和信噪比 No. 化合物名称 英文名称 10pg/L 50pg/L 100pg/L 峰面积 S/N 峰面积 S/N 峰面积 S/N 甲胺磷 Methamidophos 86969 186 686221 1035 1254159 1385 2 敌敌畏 Dichlorvos 59457 20160 509154 93043 751243 85083 3 乙酰甲胺磷 Acephate 245978 142 910716 1407 1367072 688 4 巴比妥 Barbital 520114 1147 4415531 3302 7138056 2159 5 异丙威 Isoprocarb 494918 514 3230864 988 6123197 3933 6 呋喃丹 Carbofuran 304764 294 1275089 1924 2406552 2667 7 五氯苯酚 Pentachlorophenol 53825 5560 482100 23779 849938 44228 8 二嗪磷 Diazinon 40556 18261 380916 48273 523197 61429 9 司可巴比妥 Secobarbital 94324 300 731932 490 1189533 751 10 甲基毒死蜱 Chlorpyrifosethyl 12623 187 99055 9448 177834 1334 11 氯胺酮 Ketamine 170850 4160 1405821 8081 2186500 12127 12 甲基对硫磷 Parathionmethyl 97257 1127 790141 16171 1158161 6383 13 甲萘威 Carbaryl 118475 429 893990 347 1665714 836 14 马拉硫磷 Malathion 130882 1865 945996 9755 1650610 23862 15 毒死蜱 Chlorpyrifos 60180 15973 438821 85233 757548 87845 16 倍硫磷 Fenthion 112592 1748 984018 2823 1314679 3793 17 对硫磷 Parathion 42127 1595 377614 2827 553877 6602 18 苯巴比妥 Phenobarbital 232381 412 1745006 674 2657142 1635 19 扑尔敏 Chlorpheniramine 9691 1678 45399 440 106127 1635 20 安定 Diazepam 69861 4554 529682 130966 922573 17078 21 咪达唑仑 Midazolam 36464 841 243808 1222 42450 1531 22 氯菊酯-1 Permethrin-1 36944 217 173486 400 454902 1715 23 氯菊酯-2 Permethrin-2 22834 436 103134 365 403428 1596 24 氯硝安定 Clonazepam 3404 465 38553 631 103379 827 25 艾司唑仑 Estazolam 34760 1473 250468 4871 781755 4251 26 阿普唑仑 Alprazolam 17514 1813 107805 8894 217028 21914 27 三唑仑 Triazolam 8972 890 65030 2531 95831 28493 2.3在线 GPC 净化效果 为比较在线 GPC 的净化效果，分别在 GC-MS/MS 采用与 GPC-GC-MS/MS 相同的 Q3 SCAN分析条件，进行血液样品的数据采集。采集到的样品 TIC图见图5所示，由图5可以看出， 经 GPC 净化后样品的背景干扰明显小于未净化的样品，特别是经过 GPC 的净化后，血液样品中的血红蛋白、胆固醇等大分子物质得到了一定的去除，消除了血液样品对目标成分的干扰，有利于血液样品中目标组分的定性及定量。 黑色为直接进样的样品 TIC图 粉色为经 GPC 净化的样品 TIC 图 图5 GPC净化效果的比较 2.4基质加标溶液 AMDIS 检索结果 将采集到的样品加标数据进行数据转换后，直接导入到 AMDIS 中进行检索。检索结果表明即使在 100 ug/L 的加标浓度下，有10个化合物被检索出来(见图6)，而未检出化合物因血液样品中的基质干扰而无法检索出来，如三唑仑被血液中的胆固醇而包裹而无法检索到。同时经过 GPC 净化后，消除了生物样本中的基质干扰，使得检索的相似度高于直接进样的样品。 由此表明， Scan 数据结合 AMDIS 对毒物排查，虽可以检索出部分化合物，但对于痕量化合物，特别是基质干扰影响大的化合物，往往无法筛查出来。而利用 MRM 和 SCAN 同时采集时， MRM 高的灵敏度可以有效减少基质对目标化合物的影响，同时也不会影响 SCAN 的灵敏度； MRM方式可对重点筛查的化合物进行重点监控，而利用SCAN 数据可直接进行 AMDIS 检索， AMDIS 检索结果可以对 MRM 监测的化合物进行补充，防止在司法鉴定及刑事案件中的漏检。 图6加标样品利用AMDIS检索结果 结论 在无需标准样品情况下，采用岛津公司 GPC-GCMS-TQ8040 在线凝胶色谱净化结合三重四极杆气相色谱质谱联用仪建立同时筛查公安系统日常毒物排查的166种毒物的分析方法。该方法样品前处理简单，在10 ug/L 基质加标溶液中，26种毒物的目标组分均能被检出，且各组分响应信号高；同时因整个采集范围内不分时间段，可以避免仪器维护过程中目标物质因保留时间的变化而导致其漏检发生，，可以准确、无遗漏地对重点监测的166种毒物进行定性及定量分析；同时利用 AMDIS 对采集到 100 ug/L 基质加标溶液的 Scan 数据分析，检出10种化合物，可以防止日常毒物排查过程中的漏检情况。本方法操作简单便捷，分析速度快，为公安系统日常的毒物分析提供借鉴。 田岛津全球应用技术开发支持中心 滥用药物分析和中毒致死案件已经成为公安系统司法鉴定的重要部分。生物检材成分复杂且存在大量干扰物，GCMSMS的多反应监测模式（MRM）能有效降低背景干扰，具有更高的选择性和分析灵敏度。作者采用岛津公司GCMS-TQ8040三重四极杆气质联用仪，结合岛津Smart MRM数据库毒物版，在无需标准品的情况下，建立GC-MS/MS法筛查血液样品中166种常见毒物、农药及镇定剂类等物质的方法。血液样品经简单前处理后，分别添加28种日常毒物混标，采用所建立的MRM+Q3 SCAN同时采集的方法对目标组分进行灵敏度考察。在10 μg/L浓度下，血液样品中的28种常见毒物均被筛查出来，且组分相应信号高，信噪比均高于600，同时利用AMDIS对采集的Scan数据进行分析，可以防止在司法鉴定中的漏检现象。本方法可为公安系统日常的毒物分析提供借鉴。