阿胶中特征肽段检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法定性分析阿胶药材 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用定性分析阿胶的方法。本文参照《中国药典(2015版)公示标准》中阿胶项下，使用胰蛋白酶酶解阿胶样品，选择阿胶的特征肽段作为定性依据。阿胶对照药材和市售药材样品特征多肽对应的两对特征离子满足药典中要求的 MRM 色谱峰中信噪比大于 3：1的规定，表明方法及系统可用于特征肽段的检测。本方法能够完全满足药典的要求，实现阿胶药材的快速、准确定性分析。 关键词： 超高效液相色谱三重四极杆质谱阿胶定性分析特征肽段 胶类药材是传统中药材，以补血、升血功能而著称。阿胶中含量85%以上的主要成分是胶原蛋白，关于阿胶原料的鉴别是其质量控制中的关键步骤。在《中国药典(2010版)》中通过茚三酮显色法进行定性鉴别，此方法缺少特异性，不易对其来源的胶原蛋白进行区分。已有文献报道，使用胰蛋白酶对阿胶、牛皮胶和猪皮胶等不同来源的明胶类物质进行酶切处理，通过液质联用技术发现不同样品胶的酶解产物存在特征肽段的差异。从而证明通过检测样品胶中的特征肽段可以对样品胶的种类进行鉴定。2015版中国药典拟收录阿胶、龟甲胶和鹿角胶三种胶类药材采用液质联用检测特征肽段的定性方法，为此类药材的质量控制提供更加可靠和准确的分析依据。 本文利用岛津三重重极杆液质联用系统 LCMS-8040 对阿胶中的特征肽段进行分析，建立了阿胶定性鉴别的分析方法，可为该类样品的分析提供参考。 1 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用系统。具体配置为 LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5(在线脱气机)， SIL-30AC(自动进样器)，CTO-30AC(柱温箱)， CBM-20A(系统控制器)， LCMS-8040(三重四极杆质谱仪)，LabSolutions Ver. 5.53(色谱工作站)。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack XR-ODS ⅢI 2.0 mmI.D.x75 mm L.， 1.6 pm 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液流速：0.3mL/minB相-乙腈柱温：40℃ 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 进样量：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，洗脱程序见表1. 表1.梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 5 4.00 Pumps Pump B Conc. 20 6.00 Pumps Pump B Conc. 60 7.00 Pumps Pump B Conc. 5 10.00 Controller Stop 质谱条件 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q1 Pre Bias (V) 阿胶特征肽段 540.00 612.40 -38.0 -22.0 -22.0 924.30 -38.0 -24.0 -40.0 1.3对照品和样品配制及前处理方法 取阿胶对照药材或待测样品粉末0.1g， 加入1%碳酸氢铵溶液50mL， 超声处理 30 min，用微孔滤膜滤过。参照《中国药典(2015版)公示标准》阿胶项下，取滤液100uL， 置于进样瓶中，加入胰蛋白酶溶液10 pL(用1%碳酸氢铵溶液配制成浓度为1 mg/mL的胰酶溶液)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试液。 2结果与讨论 2.1阿胶对照药材的 MRM 色谱图 图1.阿胶对照药材特征多肽的 MRM 色谱图 LCMS分析获得阿胶对照药材特征多肽的 MRM 色谱图，保留时间3.14 min， 图1中两对特征离子对 540.00>612.40，540.00>924.30 的信噪比分别为 45555 和938838，充分满足药典中 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 要求的色谱峰信噪比大于3：1 的要求。 2.2实际样品分析 对两种市售阿胶药材样品进行分析，结果如图2、3和表3所示。 图2.样品1的MRM色谱图 图3.样品2的MRM色谱图 表3.实际样品中阿胶定性分析结果 样品编号 离子对信息 保留时间 (min) 峰高 峰面积 S/N 样品1 540.00>612.40 3.18 37884 126797 53991 540.00>924.30 119509 398920 147413 样品2 540.00>612.40 3.18 1054 3566 1544 540.00>924.30 3473 10893 5347 3结论 本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8040测定阿胶中特征肽段，实现阿胶定性分析的方法。该方法所检测的阿胶特征肽段 MRM 色谱图中两对离子对 540.00>612.40，540.00>924.30的响应明显，满足药典中要求的色谱峰信噪比大于 3：1的要求，市售阿胶药材样品分析结果表明所测2个样品中均含有阿胶成份。因此，本方法可为应对药典要求实现阿胶药材的快速、准确定性鉴别提供参考。 色 谱 柱：Shim-pack XR-ODS III 2.0 mm×75 mm, 1.6 μm流 动 相：A 相-0.1% 甲酸水溶液B 相-乙腈流 速：0.3 mL/min柱 温：40℃