血清中25-羟基维生素D2/D3检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-410 Excellence in ScienceLCMSMS-270 岛津全球应用技术开发支持中心上海市淮海西路570号红坊E楼 咨询电话：021-22013542http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定血清中25-羟基维生素D2/D3含量 LCMSMS-270 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用，建立了血清中25-羟基维生素 D2/D3 的定量检测方法，并依据临床检验相关指导原则完成了方法学验证。实验结果表明，该方法对血清中25-羟基维生素 D2/D3测定的可报告范围为5-500 ng/mL，日内和日间精密度(%CV)分别为1.4-4.6%、3.3-6.9%，准确度范围为86.7-111.8%。该方法分析速度快、稳定性和准确度好，适用于血清中25-羟基维生素D2/D3的定量分析，能够为临床检验行业的从事人员提供参考。 关键词： LCMS-8045 25-羟基维生素 D2/D3 血清 临床检验 维生素D是一类脂溶性激素原，对人体的骨骼健康，钙、磷的体内平衡调节起到重要作用，此外维生素D还有着广泛的非骨骼效应，与心血管疾病、免疫疾病、糖尿病和肿瘤等疾病密切相关。维生素D的缺乏可导致骨骼发育受损，以及各类慢性疾病的发病风险增加，如类风湿性关节炎、软骨化、冠心病、糖尿病和肿瘤等。人体维生素D 的来源主要有两个途径，，一是通过膳食途径摄入的维生素D2(酵母或真菌)和维生素D3(鱼、鱼肝油或蛋黄)，二是机体经光照将皮肤中的7-脱氢胆甾醇转化为维生素 D3。 维生素D 在肝脏中可转化为25-羟基维生素D(25OHD)， 从而被机体转运或储藏，因此体内25OHD 含量可有效反映人体维生素 D的营养状态。此外， 25OHD 在体内稳定，半衰期长，其浓度水平与体内维生素D含量直接相关，因此 25OHD 可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素Ｄ水平。 目前，25OHD 的检测方法有多种，包括免疫检测、HPLC法和 LC-MSMS 方法等。其中，LC-MS/MS 法具有特异性强、准确度高、分析时间短等特点，被认为是评价机体维生素D营养状况的“金标准”。对此，我们使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用，并采用D6-250HD2和D6-25OHD3 为内标，建立了血清中25OHD2/D3的定量分析方法，并结合临床检验相关指导原则，完成了方法的全验证，以供相关从事人员参考 1.1仪器 岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8045 联用系统。具体配置为：LC-30AD×2 输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器，CTO-20AC 柱温箱，CBM-20A系统控制器， LCMS-8045 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.86 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色 谱柱： Shim-pack XR-C8(2.0 mm I.D.× 50 mm L.，2.2um) 动相 流 ：A相-2mM乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)；B相-2mM 乙酸铵甲醇溶液(含0.1%甲酸) 流速柱温：225℃进样量：5pL ：0.4mL/min 自动进样器温度 ：10℃ 洗 脱 方方式 ：梯度洗脱，B相初始浓度为85%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.50 Pumps Pump B Conc. 85 3.00 Pumps Pump B Conc. 98 4.00 Pumps Pump B Conc. 98 4.10 Pumps Pump B Conc. 85 6.00 Controller Stop 质谱条件： 离子源：ESI(+)加热模块温度： 300℃雾化气流速： 3.0L/min干燥气流速：10.0L/min加热气流速：8.0 L/min扫描模式：多反应监测(MRM)接口温度：300℃驻留时间：59msDL温度： 150℃MRM参数：见表2 表2MRM参数 名称 CASNo. 前体离子 产物离子 Qi Pre Bias (V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) 250HD2 21343-40-8 413.40 395.35* -27.0 -9.0 -18.0 355.35 -27.0 -10.0 -23.0 250HD3 63283-36-3 401.40 383.35* -13.0 -9.0 -25.0 365.35 -26.0 -10.0 -12.0 D6-25OHD2 419.45 401.40* -28.0 -10.0 -13.0 355.35 -28.0 -8.0 -16.0 D6-250HD3 407.45 389.40* -27.0 -10.0 -26.0 371.35 -27.0 -11.0 -17.0 *表示定量离子对 1.3样品制备 1.3.1标准工作曲线配制 称取 4.0 g BSA 溶于100 mL PBS， 配制 4%BSA 溶液作为血清的替代基质溶液，用于配制LCMSMS-270标准工作曲线。用甲醇配制浓度为 100 ug/mL 的 250HD2和25OHD3混合标准储备液，随后用甲醇将混合标准溶液逐级稀释成浓度为 0.5 ug/mL、1.0 pg/mL、2.0 ug/mL、5.0 ug/mL、10 ug/mL、20 ug/mL 和 50 ug/mL的标准工作液。取10 pL标准工作液加入990 pL替代基质溶液，依次配制成标准曲线。用甲醇配制浓度为 25 ug/mL 的 D6-25OHD2 和 D6-250HD3的混合内标储备液，再用甲醇稀释为浓度为 250 ng/mL的内标工作液。 1.3.2样品前处理方法 取50 uL样品于1.5 mL离心管中，加入10 pL的内标溶液，再加入140 pL甲醇，涡旋蛋白沉淀，13000g高速离心10 min， 取上清液进样分析。 日内精密度和准确度考察：一天内制备4批不同浓度(LOQ、MOQ和HOQ)的样本，每批当中不同浓度的样品平行处理5个。样样进样分析后，统计精密度变异系数(CV)和准确度。 日间精密度和准确度考察：每天制备2批不同不度 (LOQ、MOQ和HOQ)的样本，每批当中不同浓度的样品平行处理5个，连续考察3天。统计精密度变异系数(CV)和准确度。 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 图125OHD2和25OHD3 (20 ng/mL)及其内标物(50ng/mL)的MRM色谱图 2.2替代基质与血清基质一致性验证 考虑到正常人血清中含有一定量的25OHD， 空白血清样品经处理分析后，检测到一定量的25OHD3， 但未检出250HD2(如图2所示)。因此不宜使用空白血清配制 25OHD标准曲线，而考虑用 4% BSA 溶液作为血清的替代基质溶液。在此，需要对替代基质与血清基质进行一致性验证。 图2空白血清样品分析结果 2.2.1替代基质标曲和血清标曲的比较 分别用血清和4% BSA 溶液依照“标准工作曲线配制”中的方法，配制标准曲线溶液，样品经过前处理后，进样分析，分别绘制出血清基质标曲和替代基质标曲(如图3和4所示)。 3.5404555.05.5 400 Cone. Rato 图325OHD4% BSA溶液标准曲线(上图为25OHD2，下图为 25OHD3) LCMSMS-270 图425OHD 血清标准曲线(上图为25OHD2，2下图为 25OHD3) 从结果上看，4% BSA 溶液配制的替代基质标曲和血清基质标曲相比，曲线斜率基本相当(如表3和图5所示)。此外，依据标准加入法外推得到X轴负截距，可以计算出血清中 25OHD3的含量为 41.3ng/mL。 表3.替代基质标曲和血清基质标准曲线比较 图5替代基质标曲和血清标曲比较 2.2.2替代基质标曲测定血清及血清加标样品中25OHD 含量 分别制备血清及血清加标样品(加入25OHD 浓度为 15 ng/mL、50 ng/mL 和 450 ng/mL)，依照上述前处理方法，各浓度样品平行处理6份，进样分析后根据替代基质标曲计算目标物浓度，结果如表4所示。 表4.血清及血清加标样品中25OHD 含量测定结果 血清 血清加标 血清加标 血清加标 项目 (E) (E+15 ng/mL) (E+50ng/mL) (E+450ng/mL) 250HD2 250HD3 250HD2 25OHD3 250HD2 250HD3 250HD2 25OHD3 检测均值(ng/mL) 40.3 13.0 55.7 56.4 93.2 465.7 482.3 理论值 (ng/mL) - 41.3 15.0 56.3 50.0 91.3 450.0 491.3 样品数量(n) 6 6 6 6 6 6 6 6 相对误差(%RE) 2.3 13.5 1.0 12.9 2.1 3.5 1.8 变异系数(%CV) 一 2.8 5.3 5.8 2.7 3.6 4.5 2.3 从结果上看，使用替代基质标曲测定各组样品，其检测均值和理论值相对误差均<15%，变异系数<15%，均在可接受范围之内。 2.2.3替代基质稀释血清基质 采用替代基质稀释血清基质，分别测定不同稀释倍数下得到的空白基质中内源性物质25OHD的浓度，该浓度与理论值的偏差在接受范围内(相对误差均<15%，变异系数<15%)，结果如表5所示。 表5.不同稀释倍数下血清中25OHD 含量测定结果 项目 1.25倍稀释 2.5倍稀释 4倍稀释 25OHD2 250HD3 250HD2 250HD3 250HD2 25OHD3 检测均值(ng/mL) - 34.1 - 17.9 10.2 理论值(ng/mL) - 33.0 - 16.5 - 10.3 样品数量(n) 6 6 6 6 6 6 相对误差(%RE) 3.3 - 8.6 0.9 变异系数 (%CV) 5.7 - 59.2 4.6 2.2.4小结 综上所述，在血清中25OHD 的检测实验中， 4% BSA 溶液和血清配制的标准曲线，二者斜率基本一致。替代基质标曲测定血清和血清加标样品，检测结果与理论值偏差在可接受范围内。此外，采用替代基质稀释血清，对不同稀释倍数下的样样测定结果，，仍然表现出良好的准确度和精密度。因此，4%BSAPBS 溶液作为血清替代基质，用于配制 25OHD标准曲线或质控样品。 2.3线性范围及其验证 使用4% BSA 溶液配制标准曲线，按上述请处理方法和分析条件，采用内标法建立标准曲线。如图6所示， 25OHD2和 250HD3在 5-500 ng/mL 的线性浓度范围内，线性相关性良好，相关系数r分别为0.9998 和0.9997，准确度范围分别为92.2-108.0%和 95.0-109.2%。 图6250HD2和250HD3的标准曲线 确定线性范围后，还需要对线性范围进行进一步验证。配制上限浓度(H，500ng/mL)和下限浓度(L，5ng/mL)各1例，按照L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、H的体积比，混合成6个不同浓度的样品，每个样品测定2次。以理论浓度值为X，测定浓度均值为Y，计算回归方程Y=bX+a(如图7所示)。线性方程相关系数r>0.975，b在0.97-1.03范围内，表明实验结果可接受。 图725OHD2和250HD3的线性范围验证 2.4特异性验证 分别考察空白替代基质、空白替代基质加内标和5 ng/mL 替代基质加标样品，结果表明，替代基质对目标物 25OHD2/D3及其内标的检测均无干扰，同时内标亦不干扰 250HD2/D3的检测(见图8)。 图8特异性验证结果 2.5检出限验证 用替代基质配制浓度为 5 ng/mL 的25OHD样品，共处理20份样品并进样分析，统计RR值， RR 值=目标峰面积(A-25OHD)/内标峰面积(A-D6-25OHD)，数据结果(见表6)，CV%值小于20，表明 5 ng/mL 可作为方法检出限。 表6.检出限验证统计结果(n=20) 样品 250HD2 250HD3 A-25OHD2 A-D6-25OHD2 RR值 A-25OHD3 A-D6-25OHD3 RR值 1 30524 162909 0.187 41001 428336 0.096 2 27096 168014 0.161 48929 438004 0.112 3 31283 170608 0.183 48011 434552 0.110 4 28958 174152 0.166 44346 439456 0.101 5 27145 165930 0.164 43656 434848 0.100 6 25931 152855 0.170 44131 395863 0.111 7 28192 164807 0.171 44188 442351 0.100 28680 168208 0.171 46255 431137 0.107 9 28177 169696 0.166 45224 437627 0.103 10 25357 163940 0.155 44321 437362 0.101 11 26167 155843 0.168 43840 392601 0.112 12 26384 158522 0.166 45897 425985 0.108 13 29323 163174 0.180 42284 415843 0.102 14 28447 163700 0.174 43635 428778 0.102 15 27268 162107 0.168 43305 415396 0.104 16 26545 138219 0.192 40201 379425 0.106 17 26001 159800 0.163 45370 412973 0.110 18 29092 152625 0.191 40220 394639 0.102 19 26598 163945 0.162 44245 413205 0.107 20 27566 159563 0.173 39745 402631 0.099 %CV 5.7 4.9 5.9 5.5 4.4 4.6 2.6精密度和准确度验证 2.6.11 t日内精密度和准确度 用替代基质配制低、中、高三个浓度的样品，即LOQ(10ng/mL)、MOQ (100ng/mL)和HOQ(400ng/mL)。在同一天内，共处理4批样品，同一批次中LOQ、MOQ和HOQ各处理5个。样品经分析后，数据统计分析得到变异系数(%CV)和准确度(%accuracy)，结果如表7所示。 表7.日内精密度和准确度考察结果(n=20) 样品 25OHD2 (ng/mL) 25OHD3(ng/mL) LOQ MOQ HOQ LOQ MOQ HOQ 1-1 9.0 96.6 383.0 9.3 106.6 430.9 1-2 9.0 87.9 385.9 9.7 96.9 431.3 1-3 9.4 92.1 368.5 10.4 108.9 430.5 1-4 9.0 90.9 375.6 10.2 103.4 416.1 1-5 9.1 93.3 398.4 10.1 105.9 431.7 2-1 8.9 95.4 385.5 10.2 106.1 433.9 2-2 9.5 93.6 386.6 10.3 107.8 429.0 2-3 9.2 97.5 384.6 10.4 108.6 432.5 2-4 8.8 87.0 367.5 9.9 97.8 419.3 2-5 10.0 92.8 389.9 9.5 105.5 437.9 3-1 9.2 100.4 385.4 10.2 106.5 433.5 3-2 9.1 86.8 372.8 9.5 100.5 422.4 3-3 9.0 94.4 377.2 9.6 108.5 420.9 3-4 8.8 98.8 377.3 10.3 106.4 426.5 3-5 8.9 92.9 388.3 10.2 104.0 435.3 4-1 9.3 98.7 387.5 9.2 105.1 434.5 4-2 10.0 87.4 387.4 10.4 98.8 426.6 4-3 9.2 92.9 379.2 9.9 106.3 433.3 4-4 9.1 86.7 375.7 9.9 96.1 425.6 4-5 9.3 91.1 380.4 10.0 102.4 430.9 均值 9.2 93.0 381.9 10.0 104.2 429.0 %CV 3.6 4.6 2.0 3.7 3.9 1.4 %accuracy (MIN) 87.7 86.7 91.9 81.7 92.2 96.1 %accuracy (MAX) 100.3 100.4 99.6 102.9 103.8 108.9 2.6.2日间精密度和准确度 每天处理2批样品，同一批次中 LOQ、MOQ和HOQ各处理5个，连续3天。样品经分析后，数据统计分析得到变异系数(%CV)和准确度 (%accuracy)，结果如表8所示。 表8.日间精密度和准确度考察结果(n=30) 样品 25OHD2 (ng/mL) 25OHD3 (ng/mL) LOQ MOQ HOQ LOQ MOQ HOQ Day 1-1 9.0 96.6 383.0 9.3 106.6 430.9 Day 1-2 9.0 87.9 385.9 9.7 96.9 431.3 2.6.3小结 综上所述， LOQ、MOQ和 HOQ的日内精密度分别为及准确度范围分别为1.4-4.6%和86.7-109.5%，，日间精密度及准确度分别为 3.3-6.9%和 87.8-111.8%，均在可接受范围内。 2.7携带污染率验证 制备高浓度样品(H，500ng/mL)和低浓度样品(L，5ng/mL)各1例。连续测定H样品3次，得到的浓度值分别为 H1、H2、H3；再测定L样品3次，得到的浓度值分别为 L1、L2、L3。依据公式：携带污染率=|(L1-L3)/(H3-L3)|×100%，计算得到污染率。当携带污染率<2%，表明没有携带污染。实验结果如表9所示，25OHD2 和 25OHD3的计算携带污染率分别为0.06%和0.04%，表明高浓度样品分析不会造成携带污染。 表9.携带污染率考察结果 H1 H2 H3 L1 L2 L3 携带污染率 250HD2 492.0 491.0 499.6 5.3 4.8 5.0 0.06% 25OHD3 536.6 536.5 520.9 4.6 4.9 4.8 0.04% 2.8临床样品测定结果 共获取正常人血清临床样品10个，经前处理后分别进行测定，结果如表10所示。一般正常人体内 25-OHD 的含量为 10-60 ng/mL， 各临床样品测定数值均在正常范围内，因此该方法适用于临床血清样品的检测。 表10正常人血清临床样品检测结果 编号 250HD2 (ng/mL) 25OHD3 (ng/mL) 总计 (ng/mL) 未检出 25.1 25.1 2 未检出 27.9 27.9 未检出 31.5 31.5 4 未检出 29.3 29.3 5 未检出 30.2 30.2 6 未检出 30.1 30.1 7 未检出 29.7 29.7 8 未检出 30.9 30.9 9 未检出 33.1 33.1 10 未检出 33.8 33.8 结论 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用，通过替代基质配制标曲，结合蛋白沉淀法及内标定量法，建立了在 6 min 内测定血清中25-羟基维生素D2/D3的分析方法，并依据临床检验相关指导原则完成了方法学验证。实验结果表明，该方法对250HD2/D3测定的可报告范围为 5-500 ng/mL， 日内和日间精密度(%CV)分别为1.4-4.6%、3.3-6.9%，准确度范围为 86.7-111.8%，均能满足临床检测要求。该方法分析速度快、稳定性和准确度好，适用于临床实验中测定人血液中25-羟基维生素 D2/D3的含量，从而指导相关疾病治疗及临床合理用药。 本解决方案使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用，通过替代基质配制标曲，结合蛋白沉淀法及内标定量法，建立了在6 min内测定血清中25-羟基维生素D2/D3的分析方法，并依据临床检验相关指导原则完成了方法学验证。实验结果表明，该方法对25OHD2/D3测定的可报告范围为5-500 ng/mL，日内和日间精密度（%CV）分别为1.4-4.6%、3.3-6.9%，准确度范围为86.7-111.8%，均能满足临床检测要求，为临床检验行业的从事人员提供参考。