长裙竹荪中正己烷检测方案(毛细管柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012 ，24：905-909 北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923906 天然产物研究与开发Vol. 24 文章编号：1001-6880(2012)07-0905-05 长裙竹荪正己烷提取物化学组成及抑菌活性研究 陈敬华*，胡 准?，郑 化，邓 超，马 莉?，李惠森 江南大学医药学院，无锡214122；'武汉理工大学化学工程 学院，武汉430070；无限极(中国)有限公司，广州510665 摘 要：以正己烷为溶剂，对长裙竹荪子实体进行索氏提取，提取率为 1.36%。应用 GC-MS 对提取物的化学成分进行分析，Rxi-1 ms柱分离，质谱解析鉴定出55种成分，其中23种成分是首次从竹荪属中检测出来，其主要成分为：羧酸、醇、酮、倍半、芳香烃、等。提取物对伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌和枯草芽孢杆菌有很好的抑制作用。 关键词：长裙竹荪；正己烷；化学成分；抑菌作用 中图分类号：R284.2 文献标识码：A Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Extractswith n-Hexane from Dictyophora indusiata CHEN Jing-hua’HU Zhun’，ZHENG Hua’，DENG Chao'，MA L’，LI Hui-sen i School of Medicine and Pharmaceuties，Jiangnan University， Wuxi 214122，China；School of Chemical Engineering，Wuhan University of Technology， Wuhan 430070，China； Infinitus Company，Guangzhou 510665，China Abstract：The dry fruiting body of Dictyophora indusiata was extracted by n-hexane at 70 ℃ and the extraction rate was1.36%. The chemical composition of the extracts had been identified by GC-MS with a column of Rxi-1ms. Fifty-fivecomponents had been identified and twenty-three compounds among them were detected from D.indusiata for the firsttime. The major components were carboxylic acids， alcohols， ketones，sesquiterpenes， aromatics，and esters. The extractshowed a significant antimicrobial activity to Salmonella typhosa， Staphylococcus aureus，Bacterium vulgare and Bacillussubtilis. Key words：fruiting body of D. indusiato；n-hexane；chemical composition；antimicrobial activity. 竹荪一般作为整个竹荪属(Dictyophora)的总称，是一类大型真菌，在真菌分类学上，隶属于真菌界、担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属。该属目前共有12个种和变种。竹荪除对防癌、降血压等具有明显疗效外，还具有特异的防腐作用，能够抑制微生物生长“.5。文献报道显示长裙竹荪中含有萜类、脂肪酸、喹唑啉类等成分68]。本文针对长裙竹荪正己烷提取物进行组分分析，并对其抑菌功效进行初步探讨，旨在为进一步开发利用长裙竹荪打下基础。 .材料与方法 1.1 材料 ( 收稿日期：2011-02-14 接受日期：2011-06-20 ) ( 基金项目：国家自然科学基金资助项目(50873080)；无限极(中国)有限公司企业合作项目(DT产品中活性多糖质控技术及其核心多糖构效关系研究) ) ( *通讯作者Tel：86-013861704096；E-mail：jhchenwhut@126. com ) 1.1.] 长裙竹荪(Dictyophora indusiata) 子实体干品购于四川省长宁县；正正烷：AR .1.1.2 供试菌种 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、变形杆菌(Bacterium vul-gare)、伤寒杆菌(Salmonella typhosa)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黑根霉(Rhizopus nigri-cans)、总状毛霉(Mucor racemosus)由江南大学生物工程学院菌种中心提供。 1.1.3 培养基 肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0g、NaCl 0.5 g、琼脂1.5g~2.0 g，水100 mL、pH 7.2~7.4。 PDA 培养基：马铃薯20.0g、葡萄糖2.0g、琼脂2.0 g。马铃薯去皮切成块煮30 min。用纱布过滤取汁，加葡萄糖和琼脂溶化，补水至100 mL。 液体发酵培养基：0.5%CMC-Na、葡萄糖20.0 万方数据 g、玉米粉10.0 g、黄豆粉 10.0g、酵母膏2.0 g、Mg-SO，1.5 g、KH，PO 3.0 g、CaCl， 1.0 g、VB， 1.0 g，水1000mL 1.2 方法 1.2.1 提取方法 长裙竹荪子实体于粉粹粹中粉粹，80目过筛，称取 100.00g用滤纸包裹住，置于索氏提取器中连续回流萃取，正己烷为萃取溶剂，70℃回流20 次以上。萃取液滤纸过滤，滤液低温(<40℃)减压浓缩至恒重，置具塞试管中低温保存备用。 1.2.2 提取物的组分分析 低温保存的样品经正己烷适量稀释，用岛津GC-MS QP2010s 进行分析，NIST08 和 NIST08s 数据库进行检索和分析，确定各组分成分，气相色谱峰面积归一化法计算其各组分含量。 气相条件：Rxi-1ms 柱(30 m*0.25 mm*0.25um)。柱温采用程序升温：初始温度120℃，保持2min，以3℃/min 升温至180℃保持1 min， 以 10℃/min 升温至220℃保持5 min，以20 ℃/min 升温至280℃保持25 min。分流比10：1，柱流量1.0mL/min. 进样量1.0 p.L。 质谱条件：70eV的EI源，离子源温度200℃，溶剂延迟时间为1.8 min，m/z范围为50~750。 1.2.3 抑菌试验 1.2.3.1 供试菌株的准备 在无菌室中将供试菌种接入相对应的试管斜面培养基，细菌置35~37℃恒温培养箱内培养18~24h，霉菌25~28℃、酵母菌30℃培养44~48h后，置0~4℃冷藏备用。 1.2.3.2 培养基平板制备 配制好的各种菌株的培养基，121℃湿热灭菌30 min 后，冷却至50~60℃，无菌操作倾注于干热灭菌的培养皿内，每皿15~20 mL。 1.2.3.3 供试菌株悬浮液的制备及平板接种 用接种环挑取少许菌体于装有9mL无菌水的试管内，制成菌悬浮液。霉菌、酵母菌用血球计数板计数，细菌用比浊法计数。调整菌悬浮液的浓度至含孢子或菌体为 10°~10'/mL，向平板上加100 p.L菌体悬浮液，用三角刮铲涂布均匀。 1.2.3.4 用乙醚将提取物浓缩液分别稀释0、2、4、8倍进行抑菌试验。 1.2.3.5 滤纸圆片测试培养 用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm址：V 的小圆片，于培养皿中121℃湿热灭菌 30 min。将灭菌滤纸片浸入竹荪提取液中，浸泡约24h。将浸好的滤纸片贴在1.2.3.3中制备好的接种平板上，采用挥发性溶剂熏蒸法°，培养皿背面划线等分为二，一边贴提取液滤纸片，一边贴空白对照滤纸片，每边2片。贴好滤纸片的平板置于恒温培养箱中培养，细菌于35~37℃培养18~24h，霉菌25~28℃、酵母菌30℃培养44~48 h，测量抑菌圈直径，每个组合三个重复。 1.2.3.6 最低抑菌浓度(MIC)的测定10] 依据连续稀释法，将正已烷提取液(原液浓度为120.00 mg/mL)稀释后，加入培养基中混匀，按照1.2.3.3方法在平板上加100 pL细菌菌体悬浮液，用三角刮铲涂布均匀。于35~37℃培养18~24h，观察菌株生长情况。完全没有菌丝生长的最低提取液浓度为长裙竹荪子实体提取液对该菌株的最低抑菌浓度(MIC)。 2 结果与分析 2.1 长裙竹荪正己烷提取物性质及提取率 提取物得率为1.36%，呈淡黄色油状液体，竹荪子实体气味，pH 4.5. 2.2 正己烷提取物的化学成分鉴定 从长裙竹荪子实体提取物中鉴定出55种组分，占总量的99.44%。正己烷提取物的 GC-MS 总离子色谱图见图1，化学成分检测结果见表1。 图1 长裙竹荪子实体正己烷提取物的 GC-MS 总离子色谱图 Fig.11GC-MS Total ion chromatogram of D. indusiata withhexane at 70 ℃ 从表1中可知，长裙竹荪子实体的正己烷提取物中，检测出的主要化学成分类别及相对面积为：1.35%芳香烃，19.83%酮类，25.83%羧酸类，13.53%酯类，4.26%醛类，23.32%醇类(含甾醇)，4.78%倍半萜类，烷(烯)类及其它占6.48%。其中25.83%羧酸中，不饱和酸占94.21%；23.32%醇类中三种2-苯并呋喃-4-醇共占有 45.84%，在本文中未能区别这三种化合物的差异；并且亚油酸占提取 物含量的11.78%，氧杂环十三碳-2-酮占 11.58%， 居提取物组分含量的第一、二位。 表1 长裙竹荪子实体正己烷提取物化学成分鉴定表 Table Chemical compositions of D. indusiata extracted with hexane 36 29.60 324 C2 H4002 88 Isopropyl (E)-9-octadecenoate；异丙酯基-反-9-油酸 0.80 37 31.02 266 C H340 81 *E，Z-2，13-Octadecadien-1-ol；反，顺-2，13-十八烯醇 0.82 38 31.35 258 CuH300 79 *15-Hydroxypentadecanoic acid；15-羟基-十五碳酸 0.56 39 33.93 268 C18H36 0，3 *Octadecanal；十八醛 0.46 40 34.19 224 CsH28 0 87 *Z，Z-6，9-Pentadecadien-1-ol；顺，顺-6，9十五醇 3.86 41 34.27 266 C8H30 85 *cis-13-0ctadecenal；顺-13-十八烯醛 1.78 42 34.34 266 C18H30 85 * cis-11-Hexadecenal；顺-11-十八烯醛 1.65 43 37.67 410 C30H50 96 Squalene；角鲨烯 0.54 44 38.06 170 C10H1802 82 *3a，7a-Dimethyloctahydro-2-benzofuran-4-ol；3a，7a二甲基-八氢-2-苯并呋喃-4-醇 3.65 45 38.14 170 C：0H1802 80 3a，7a-Dimethyloctahydro-2-benzofuran-4-ol；3a，7a二甲基-八氢-2-苯并呋喃-4-醇2.55 46 38.25 170 C20H1802 79 3a，7a-Dimethyloctahydro-2-benzofuran-4-ol；3a，7a-二甲基-八氢-2-苯并呋喃-4-醇4.49 47 40.33 354 C21H3804 79 2，2-9，12-Octadecadienoic acid，1-glyceride；顺，顺-9，12-亚油酸-1-甘油酯 0.94 48 40.42 356 C21H4o0 77 Z-9-Octadecenoic acid，1-glyceride；顺-9-油酸-1-甘油酯 0.42 49 40.55 356 C21H4004 77 E-9-0ctadecenoic acid，1-glyceride；反-9-油酸-1-甘油酯 0.62 50 42.02 394 C23H420 75 Anthiaergostan-5，7，9，22-tetraen-3-ol；麦角-5，7，9，22-四烯-3-醇 0.38 51 42.67 264 C17H2802 88 Z，Z-Acetic acid，[3，7，11-trimethyl-2，6，10-dodecatrien-yl] ester； 3，7，11-三甲基-顺-2，顺-6，10-十二碳三烯醇-乙酸酯 0.63 52 42.88 264 C17H2802 86 E，E-2，6，10-Dodecatrien-ol，3，7，11-trimethylacetate； 3，7，11-三甲基-反-2，反-6，10-十二碳三烯醇-乙酸酯 0.86 53 43.06 398 C28H460 90 38，5a，22E-Ergosta-7，22-dien-3-ol； 38，5a，22反-麦角-7，22-二烯-3-醇 2.21 54 47.249 306 C20H3402 2，2-Propanoic acid，2.2-dimethyl-[3，7，11-trimethyl-2，6，10-dodecatrien-yl] ester；7，22 86 3，7，11-三甲基-顺-2，顺-6，10-十二碳三烯醇-(2，2-二甲基)丙酸酯 55 47.36 306 C20H3402 E，E-Propanoic acid，2，2-dimethyl-，3，7，11-trimethyl-2，6，10-dodecatrien-yl] ester； 46 85 3，7，11-三甲基-反-2，反-6，10-十二碳三烯醇-(2，2-二甲基)内酸酯 3，7，11-三甲基-反-2，反-6，10-十二碳三烯醇-(2，2-二甲基)内酸酯 注：带*号的成分是首次从竹荪属中检测到的。 Note：The components with is the first time detected from Dictyophora. 表2长裙竹荪子实体正己烷提取物对4种受试细菌的最小抑菌浓度测定 Table 2Determination of MIC of four kinds of bacteria by the extractions with n-hexane from fruiting body of D. indusiata 提取物浓度(mg/mL) Concentration (mg/mL) 供试细菌生长情况 Growth of the bacterial] 金黄色葡萄球菌 枯草芽胞杆菌 变形杆菌 伤寒杆菌 S. aureus B. subtilis B. vulgare S. typhosa 60.00 一 中 一 - 30.00 - - - 15.00 - 恤 7.50 + 十 元 3.75 + 十 + 1.875 ++ ++ ++ ++ Note："""indicates no growth；“*" indicates less growth；^** " indicates more growth；“***"indicates growth strongly. 2.3 提取物抑菌作用 抑菌试验的结果显示，正己烷提取物对各受试菌有不同的抑制作用，其中对细菌的抑菌圈轮廓清晰，抑菌圈直径有显著差异，各倍数稀释浓度下抑制细菌效果呈浓度递减趋势，在0、2、4倍都是对伤寒杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，其次为变 形杆菌和枯草芽孢杆菌；但对总状毛霉、黑根霉和啤酒酵母没有抑菌作用。 2.4 提取物对各细菌菌株的 MIC 从表2中可以看出，正己烷提取物对伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC 为 7.50 mg/mL，对变形杆菌、枯草芽孢杆菌的 MIC 为 15.00 mg/mL. 3 讨论 从长裙竹荪子实体干品的正己烷提取物中分离鉴别出55种化合物，其中有23种化合物是首次从竹荪属中分离鉴别出来的，主要成成为：羧酸类、醇类(含甾醇)、酮类、酯类、烷(烯)类、部半萜类、醛类、芳香烃。其中羧酸类、醇类(含甾醇)、酮类、酯类共占有82.51%，可能对微生物的生长有抑制作用，但是具体是那种成分(或哪几种)具有更强的抑菌效果有待深入研究。 长裙竹荪子实体的正己烷提取物的抑菌实验结果显示，提取物有抑制细菌生长的作用；与谭敬军等1等结论一致，只对细菌有效，对霉菌和酵母菌无抑制作用。而棘托竹荪的提取物12-14]对霉菌、酵母菌、细菌都有效果，特别是乙酸乙酯提取物对霉菌和酵母菌的效果比对细菌强的多，说明两个不同种的竹荪提取物所含成分不同，这有可能是不同种的竹荪的代谢产物不同所致。 长裙竹荪提取物[15，16]对抑制食物腐败有很好的效果，而正己烷提取物对广谱的致病菌如伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌都有很好的抑制作用，因此在抑制致病菌作用方面也有广泛的应用前景。 ( 参考文献 ) ( 1 Liu ZX(刘振祥)，Zhang S(张胜). 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