氨基化二氧化硅颗粒固定木瓜蛋白酶研究

生 物 工程学报Chinese Journal of Biotechnology20卷2期2004年3月Vol.20 No.2March 2004 生 物 工 程 学 报20卷288 氨基化二氧化硅颗粒固定木瓜蛋白酶研究 程凡亮 陈伶利 王 卫 刘琳琳 邓 乐 (湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081) 摘 要 采用正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，一步法制备了氨基化的二氧化硅颗粒，得到的颗粒粒径在0.3~0.5pm之间，平均大小为 0.37pm， 氨基含量和颗粒大小可控，氨基含量高达 5.6mmol/g。此颗粒经戊二醛处理后，采用共价法固定木瓜蛋白酶，固定化最适 pH6.5，最佳给酶量为15mg/g载体，固定化酶的最适反应温度为70℃，最适反应 pH为 6.5，固定化酶热稳定性，pH耐受性，贮存稳定性都明显高于游离酶，表明此颗粒可作为一种优良的酶固定化载体。 关键词 二氧化硅颗粒，木瓜蛋白酶，酶固定 中图分类号 Q814.2 文献标识码 A 文章编号1000-3061(2004)02-0287-04 从60年代起，固定化酶技术的研究迅速发展，为了提高酶的使用效率，克服游离酶对热、酸、碱、有机溶剂等因素的不稳定性，人们对酶的固定化进行了广泛深入的研究，出现了许多固定化材料和方法1-4]，但相比较而言，无机载体比有机载体更耐生物降解、有更高的热稳定性和更低的价格5]。多孔玻璃、多孔硅球、氧化铝及硅藻土是目前应用较为广泛的无机载体，但它们在用于固定化酶时需要经过强酸或强碱的活化，再在甲苯中长时间回流进行硅烷化，载体的制备过程繁琐，且氨基含量不高16，71，因此制备出更加高效、低成本、易于制备的新型固定化载体和新的固定化方法是众多科研工作者的目标。 木瓜蛋白酶是一种来源广泛的巯醇类植物蛋白酶，其活性位点由 Cys-25、His-159 和Asp-158组成。木瓜蛋白酶对蛋白质、短肽化合物、氨基酸酯以及酰胺等多类化合物的水解反应具有良好的催化活性，同时也可用于催化合成短肽和低聚氨基酸，在食品、轻纺、医学等领域有着广泛的应用。木瓜蛋白酶在酶动力学和结构学上都已得到深入的研究18.91，其在各种载体上的固定化在国内外也有广泛研究乏1-4]，因此很适合作为评测酶固定化方法效率的模式酶。 本文在以上前人的基础上，分析比较现有固定化材料和方法，采用微乳液法，以氨水为催化剂，使正硅酸乙酯与 N-(β-氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的水相中同步水解，一步法制备了大小均匀的氨基化二氧化硅颗粒，经戊二醛处理，采用温和的共价法，以木瓜蛋白酶作为固定对象，研究了此种颗粒作为酶固定化载体的可行性，取得了满意的结果。 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器 木瓜蛋白酶(Sigma，2100u/g)， N-(β-氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPS，sigma)，甘氨酸(Sigma)，戊二醛(25%，上海化学试剂公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，上海化学试剂公司)，正硅酸乙酯(TEOS，上海五联化工厂)，EDTA(BBI)，盐酸半胱氨酸(BBI)。正己醇、环己烷等其它试剂均为市售分析纯。 JSM-5600LV 型扫描电子显微镜(日本电子光学公司)，UV751GD型紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂)，JY92-Ⅱ型超声细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)，85-2型恒温磁力搅拌器(江苏)。 1.2 载体制备 采用何晓晓等人L10]的方法，并加以改进。按照环己烷：Trion X-100 ：正己醇=4：1.15：1的比例配成混合液，超声波振荡均匀，形成浑浊乳状液，磁力搅拌下，加入一定量的0.05mol/L的氨水，溶液变为透明，15min 后加入一定量的TEOS，0.5h后再加入一定量的 AEAPS，反应时间为20h，反应完毕后加入丙酮破乳分离颗粒，加入无水乙醇洗涤颗粒，重复洗涤5次，烘箱干燥。载体中游离氨基含量的测定采用电位滴定法11 1.3 木瓜蛋白酶的固定化 取一定量的氨基化二氧化硅颗粒，分散于 PBS(0.1mol/L，pH8.0)中，超声分散，通氮 30min 驱氧，加入戊二醛至最终浓度为5%，室温下磁力搅拌2h，离心去上清，再用 0.01mol/LPBS清洗3遍，去除残余戊二醛。将活化后的载体加入一定 ( 收稿日期：2003-09-19，修回日期：2003-12-22。 ) 量的木瓜蛋白酶溶液，室温下摇床振荡，离心去上清，加入一定量的甘氨酸封闭 30min， 离心弃上清，以 PBS(0.01mol/L，pH7.0，含0.001mol/L EDTA，0.05mol/L Cys)清洗3次，得固定化酶。 1.4 酶活测定 酶活测定采用福林-酚法121。 固定化酶活力的测定：在固定化酶中加入1mL 0.1mol/L的 PBS(含0.05mol/L Cys 和 0.01mol/L EDTA)，40℃预热，加入1mL 40℃预热的2%酪蛋白溶液，40℃反应 10min，加入10%三氯乙酸2mL，摇匀静置 10min 后过滤，取滤液1mL 加5mL0.4mol/L Naz CO，溶液及 1mL福林-酚试剂40℃显色 15min，测定 OD680 游离酶活力测定：将酶溶于0.1mol/L PBS(含 0.05mol/LCys 和 0.01mol/L EDTA)，取 1mL按上述方法测定游离酶活力。 固定化率=(加入酶的总活力-上清酶的总活力)/加入酶的总活力 酶活回收率=固定化酶的总活力/加入酶的总活力 2 结果与讨论 2.1 颗粒的形态与大小 图1所示为本文中制备的氨基化二氧化硅颗粒的扫描电子显微镜照片，颗粒大犬均匀，为规则的球形，粒径在0.3~0.5pm之间，平均大小约为 0.37um，粒度分布窄。 图1 氨基化 SiO，颗粒扫描电子显微镜照片(×20000) Fig.1 SEM photo of SiO2 particles(×20000) 2.2 载体的游离氨基含量 表1 氨基化 SiO， 颗粒中游离氨基含量 Table 1 Free amine group content of SiO2 particle TEOS：AEAPS molar ratio 1：1 2：1 4：1 Amine group content/(mmol/g) 5.6184 4.9997 3.2210 采用了不同比例的 TEOS 和 AEAPS 制备了二氧化硅颗粒，颗粒中游离氨基含量见表1。由表1可见，随 AEAPS：TEOS比例的增高，颗粒中游离氨基含量也增大，在比例为1：1可达5.6184mmol/L，这远高于传统的多孔玻璃和多孔硅球的氨基含量，在用作固定化酶载体时可以提供更多的固定位点，使其作为高效酶固定载体成为可能。而且此种颗粒的表面氨基基量可以在合成时通过改变 TEOS 和 AEAPS 的比例而进行控制，为这种载体适用于固定多种不同类型的酶打下了基础。在本实验中采用氨基含量 5.6mmol/g 的颗粒用于固定木瓜蛋白酶的载体。 2.3 固定化时间的影响 每0.01g载体中加入 1mL 的 10mg/mL 的木瓜蛋白酶溶液，不同时间测定上清蛋白的含量。从图2中可以看出，载体对酶的吸附量随固定化时间的延长而增加，6h达到最大值，吸附量可达酶 270mg/g载体，因此在以下的固定化实验中固定化时间均采用6h。载体的最大载酶量较大，也说明该载体的活性基团含量较高。 图2 固定化时间对酶吸附量的影响 Fig.2 Effect of reaction time on enzyme uptake 2.4 pH的影响 在不同pH 值的 0.1mol/L PBS 中进行了木瓜蛋白酶的固定化反应，其相对活力如图3所示，当pH=6.5时，固定化酶的活力达到最大值。戊二醛与氨基的反应随 pH的增加而增加，但高 pH对酶活性不利，固定化结合位点越多，酶活性越低。较低pH固定化时与酶的结合点少，酶活性高。 图3 固定化反应介质 pH 值对酶活力的影响 Fig.3Effect of reaction pH on the relative activity 2.5 给酶量的影响 从图4中可以看出，在给酶量为 5mg 和 10mg时固定化率可达100%，随着给酶量的增加，固定化率下降，当给酶量为20mg时，固定化率为71.8%，与此相反，随着给酶量的增加，所得的固定化酶的相对活力逐渐增大，在给酶量 15mg 时为根握根据以果，在固定定化的制备实验中，每次给 酶量为 15mg/g载体，这样就能以较低的给酶量得到较高活力的固定化酶和较高的固定效率。 particles/(mg/g) 图4 给酶量与相对活力及固定化率的关系 Fig.4 Effect of the ratio of enzyme and carrier on therelative activity and enzyme uptake 一- Enzyme uptake； Relative activity 2.6 固定化酶的最适反应温度 取游离酶和固定化酶，在40~80℃范围内(温度间隔为10℃)，分别测定固定化酶和游离酶的活性。图5表明，固定化酶的最适温度比游离酶提高了10℃，说明固定化酶的热稳定性较高，这可能是因为固定化过程稳定了酶分子的构象，因而使得固定化酶的临界变性温度提高。 ALS.IL 图5 酶活力与温度的关系 Fig.5 Effect of temperature on relative activity of solubleand immobilized enzyme -●- Soluble enzyme； -- Immobilized enzyme 2.7 pH值对酶活力的影响 从图6可见，固定化酶的最适 pH较游离酶低0.5个单位，且固定化酶的相对活力-pH曲线要平缓得多，说明固定 110 图6 pH对酶活力的影响 Fig.6 Effect of pH on relative activityof soluble and immobilized enzyme -●-ssoluble enzyme；一- immobilized enzyme 化酶有更好的酸碱耐受性。这可能是此载体为带氨基的载体，是一种偏碱性的载体，使得载体表面通局部 pH值发生变化，从而使得固定化酶的最适 pH向酸性方向偏移，固定化后，稳定了酶分子的构象，使固定化酶的 pH 范围变宽。 2.8 储存稳定性 游离酶在冰箱(4℃)放置2周后，活力全部丧失，而固定化酶活力仍保持在80%以上，表明固定化酶的贮存稳定性能明显优于游离酶。 ( REFERENCES(参考文献) ) ( [1]He F (贺枫)， Liu LJ(刘立建)， Zhuo RX(卓仁禧). 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SiO particles containing amine groups were synthesized by synchronous hydrolysis of tetraethylorthosilicate(TEOS)and N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane (AEAPS) in W/O Microemulsion of Triton X-100/cyclohexane/ammoniumhydroxide system. The obtained particles have a diameter range from 0.3pm to 0.5pm， and their average size is 0.37um and canbe controlled by adjusting water to surfactant molar ratio and water to TEOS and AEAPS molar ratio. Compared with traditionalporous silica beads， these particles contain much more amine groups and their amine group content can be easily changed in theprocess of synthesis.Papain was immobilized on the particles which were treated by glutaraldehyde with covalent method. Theoptimum immobilization conditions of enzyme were as follows： enzyme load was 15mg/g carrier， pH was 6.5. The pH and tem-perature optima were 6.5 and 70℃ for immobilized enzyme. All above indicate this kind of particle can be a good enzyme immo-bilization carrier. Key wordsSiO2 particle， papain， enzyme immobilization ( Received：09-19-2003 ) ( * Corresponding a uthor. Tel： 86-731-8872927；E-mail： D e ngle@ mail.hunnu. edu. cn ) SL....lllio AR 4111 川111.llllp 微生物生产辅酶Q 辅酶Q(CoQ)作为酶的辅助因子，可用于治疗多种疾病。有重要价值。作为医药产品，有针剂型和口服型。CoQ的结构与维生素K相近，能强化其他酶的作用效果，且是强力的抗氧化剂，有助于保护细胞不被破坏性的氧化作用所伤害。它对细胞中有“发动机”之称的线粒体及其正常功能也起关键性作用，如果线粒体中 CoQ 含量不足，则多种酶活力均明显下降。例如帕金森氏症患者的线粒体出现机能障碍即与 CoQio水平有关。美国研究人员将 CoQio用于该患者治疗，可使病症缓解，并能延缓44%，线粒体得到增强，也无副作用，有望成为帕金森氏症的治疗用药。实际上，CoQro具有多种功能作用，它能改善心肌代谢和心输出量，抗心率失常和抗醛固酮，并可降低血压，临床上可作为心力衰竭、冠心病和高血压病的辅助治疗。此外，还可用于治疗原发性和继发性醛固酮增多症和慢性肝炎，对延缓人体衰老有一定作用。 目前国内外都在探究通过微生物途径扩大 CoQio的生产*。日本研究人员从胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)获取 CoQio约 0.28mg/g；从诺维鲁斯假丝酵母( Candida novellus )、产母假丝酵母(C. utilis )、压榨酵母中获得比胶红酵母略低的类似的CoQio量；还有短梗霉(Aureobasidium sp.)、丝孢酵母(Trichosporon sp.)也有生产 CoQro的能力。在细菌当中发现根癌农杆菌能产CoQro(0.26mg/g)，经诱变后获得突变株，在最适通气条件下从发酵液中得到 CoQio 84mg/L，最高达 211mg/L，细胞内累积 CoQro为5.1mg/L。某些根癌菌、原氨杆菌(Protoaminobacter sp.)均合有合成 CoQro的能力。用一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)发酵生产CoQro，可提高产量10%，但需要添加0.03%~0.07%的非离子表面活性剂(系一种油脂品)；其他一些细菌如缺陷假单胞单、深红红螺菌、球形红假单胞菌以及沼泽红假单胞菌同样在加入非离子表面活性剂的情况下均可获得类似结果。所获发酵培养液的菌体含有 CoQio 2100pg/g，而对照为 1500pg/g，因此，控制发酵过程中的通气、因养因素及表面活性剂对 CoQro的生产均有重要意义，用离子交换树脂可使产品回收率达97%。在我国已开展这方面的研究，如重庆第三军医大学研究人员用某些光合细菌生产 CoQro取得了良好的效果，菌体内含量普遍较高，尤其是红螺菌科的细菌更是如此。用荚膜假单胞杆菌(Rhodopseudo-monas capsulatus)培养4天，菌体 CoQio质量浓度从 15.213mg/L提高到20.365mg/L，产量提高约 33.87%，但生产能力还需进一步提高。值得注意的是，日本利用光合细菌发酵生产 CoQio有一定优势，早已实现 CoQro的工业化生产。 总之，基于辅酶特别是辅酶Q10众多的功能作用和广泛的用途，可充分利用微生物本身的特定优势，结合现代生物技术有效应用、改造或构建新的菌种以提高 CoQro的生产能力，将为扩大 CoQro规模生产开辟新的途径。 (柯为供稿) *通讯作者。 Tel：E-mail： Dengle@mail. hunnu.edu.n中国科学院微生物研究所期刊联合编辑部 http：//journals. im.ac. cn 米 获取 CoQo不仅来自动植物组织，更重要的来源是各种微生物。 C中国科学院微生物研究所期刊联合编辑部 http：//journals. im.ac.cn