化学药中主要物质含量检测方案

阿维菌素发酵过程糖含量测定三种方法比较 摘要：三种常用方法测阿维菌素发酵过程糖浓度,比较得出阿贝折光仪法操作简单、快捷、准确，能够控制发酵液糖的含量，利于发酵过程控制。 关键词：阿维菌素；阿贝折光仪；糖含量 The Comparison of Three Methods on Measuring the Sugar Content of Abamectin Fermentation Process Abstract: Comparing three methods on the sugar content of abamectin fermentation process,abbe refractometer method is simple ,fast, accurate,and able to control the sugar content of fermentation,which will conducive to the fermentation process control. Keyword: abamectin; abbe refractometer; sugar content 阿维菌素是一种农用兽用杀虫、杀螨剂，大环内酯双糖类抗生素化合物。由阿佛链霉菌经二级生物发酵、化学提取、精制而成；阿维菌素的发酵工艺是通过一系列工艺参数来实现的。这些参数中包括一是物理参数，即温度、压力等,二是化学控制参数，即pH、糖的浓度等；其中糖的浓度是控制发酵过程中的重要参数之一；由于碳源对于发酵过程菌体生长及阿维菌素合成都有较大影响。因此，测知发酵过程中糖浓度变化，对阿维菌素发酵控制有重要的指导意义， 因为糖浓度变化影响菌种在发酵过程阿维菌素效价的变化，效价是发酵产量重要指标，效价低就意味着产量低。糖浓度低于控制指标，得不到及时补给，发酵液的菌丝就会生产缓慢甚至停滞生长，造成减产，为此对糖浓度检测方法要简便、快捷、准确，要及时满足工艺要求。 测糖的方法有许多常用的有菲林法、3，5一二硝基水杨酸法(DNS)、阿贝折光仪。 测糖菲林法是在加热条件下，直接滴定已标定过的费林氏液，费林氏液被还原析出氧化亚铜后，过量的还原糖立即将次甲基蓝还原，使蓝色褪色，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色一棕色一砖红色(沉淀)，根据样品消耗体积，计算糖含量。 3，5一二硝基水杨酸法(DNS)是在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被3，5一二硝基水杨酸氧化为糖酸，加热进一步产生一种棕红色的氨基化合物，在540 nm波长处有最大吸收，在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质的深浅成一定比例关系。 阿贝折光仪测糖是利用光线折射的原理测定不同浓度糖的折光特性。 前两种操作时间较长，步骤多，而且样品要经除去蛋白质后再测，存在人为因素对颜色变化的把握，同时要作平行样，影响及时补糖，滞后工艺控制。作者查询文献得知国内青霉素发酵、四环素发酵过程采用阿贝折光仪测糖，为此受到启发，作者引用该仪器来测定阿维菌素的发酵过程糖的浓度，经过三种方法的对比试验，发现该仪器测定方法完全适合阿维菌素发酵过程糖浓度测定。通过实验证明阿贝折射法比菲林法、DNS测糖方法所用时间少，而且数据可靠，并能及时调整发酵过程中糖的浓度，满足工艺要求。同时不需用化学试剂，减少对环境的污染，并节约了生产成本。 由于发酵工艺所需原辅料的质量指标是根据工艺要求而定，所以质量标准企业可按照工艺要求而自定企业内部标准，生产中发酵液的各种测定只要方法简捷、数据可靠，满足工艺要求、符合企业标准即可。 1 实验条件 1．1 仪器、设备、试剂 1．1．1 阿贝折光仪；洁净工作台；恒温恒湿摇床；分光光度计721,阿维菌素发酵液：实验室自；DNS法所用试剂：DNS显色剂、有酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠、氢氧化钠、3，5一二硝基水杨酸、葡萄糖、碘一碘化钾；菲林发所用试剂：氢氧化钠、硫酸铜、葡糖糖。 1．2 测样条件 温度25℃；纯化水折射率1.3325；光源白光。 1．3 实验部分 1．3．1 发酵液处理与测样配制阿维菌素的发酵培养基(20100921，20100922 ，20100923)三批各60瓶，使用1000 mL的三角瓶，每瓶装量为500 mL，消毒后温度降至与发酵培养一致的温度28℃，然后无菌接种，三批发酵液分别放置三台摇瓶机进行发酵培养,温度、湿度、转数控制在于生产工艺规定的范围内。所取发酵液样用滤纸过滤到试管里，取滤液滴到折光仪测试点，并读数；同时按菲林法和3,5-二硝基水杨酸（DNS)测发酵液糖浓度。 1.3.2 样品测定 1.3.2.1 折光法 取过滤法后阿维菌素发酵液用干净滴管加在折射棱镜表面，并读数。 1.3.2.2 菲林法吸取费林试剂甲液(0.1 g/mL氢氧化钠溶液)及乙液(O.05 g/mL硫酸铜)各5.O0 mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水10 mL，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1 mL的过滤后发酵液，加热使其在2 min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积，平行操作取其平均值。 1.3.2.3 DNS法先绘制葡萄糖标准曲线，取适量阿维菌素发酵液于离心管中，3 500 r／min离心15 min，取上清液加人25 mL容量瓶中，加入DNS试剂5 mL沸水浴5 min，冷水冷却后定容，以空白作对照测定520nm波长下的吸光度。 1.3.3 数据分析 连续三批阿维菌素发酵情况良好，发酵过程糖消耗速率正常，菌丝生长正常，将三批发酵在相同发酵周期内，用三种不同方法测得糖含量数据分别进行统计，结果见表1。 根据实验数据分别对三种方法进行相对标准偏差 计算得出阿贝折光仪测糖相对标准差RSD是2.58％，菲林法相对标准差RSD是2.43％，DNS法相对标准差RSD是2.09％。 1.3.4 实验结果 在同样实验条件下，得出阿贝折光法、DNS和菲林法对阿维菌素连续三批发酵液样中糖含量的数据结果接近，没有大的差异，RSD数据显示三种方法的精密度与准确度都能够保证阿维菌素发酵液的糖浓度含量，比较而言阿贝折光法时间短，只需3分钟，操作简单、数据准确，不需要绘制DNS的标准曲线，不需要菲林试剂的配制，能及时满足工艺要求，可 随时根据检验结果及时调整发酵液中糖的含量，对阿维菌素菌种生长有利，菌丝衰老过程得到控制，分泌阿维菌素量提高。在这样的前提条件下，产量得到了提高。阿贝折光法适合大规模的生产，并且检验人员容易掌握。而DNS、菲林法约需40 min，操作环节复杂、检验成本较高。 2 讨论 2．1 实验过程的注意事项 环境的温度、发酵液的温度对测样的数据影响较大，一定要严格控制按照仪器使用方法进行操作，将发酵液的温度和环境温度控制在25℃在开始测样，因为物质的折射率与密度有关，温度不同，密度不同，所以在不同的温度下测定同一样品的折射率是不同的，温度高所测糖浓度偏低，温度低测糖浓度会偏高。 2.2 实际生产运用 通过三种方法比较，DNS、菲林法操作步骤多多，得出阿贝折光仪用于阿维菌素生产中间体检验，间单快捷、数据出具及时准确，能正确指导发酵工艺人员对发酵状况做出正确判断。并减轻化验员的劳动强度。化验岗位的试剂使用量减少，不用配制菲林试液并进行标定，不用再定期绘制DNS法糖标准曲线图，在生产过程中检验试剂的排放减少，减轻对环境的污染程度。生产过程中，可以定期对阿贝折光仪所测数据进行菲林法、DNS法做对照实验，观察数据有否偏离。 PAGE - 1 -