三种核酸染料的比较研究（GelRed应用）

疾病监测2011年5月30日第26卷第5期 Disease Surveillance， May 30， 2011，Vol. 26，No. 5·388·◇技术与方法◇ 三种核酸染料应用于细菌脉冲场凝胶电泳染色的比较研究 娄静，刁保卫，李伟，崔志刚，阚飙 摘要： 目的 比较 Gelred、GoldView 及溴化乙锭(EB)三种染料在病原菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)中的染色效果，选择更为安全和灵敏的核酸染料，并形成标准化操作应用于病原菌分子分型监测网络 PulseNet China。 方法选择霍乱弧菌作为评价菌株，按照病原菌分子分型监测网络(PulseNet)的 PFGE 标准操作方案进行电泳，采用 Gelred、GoldView及EB三种染料分别染色，分析比较实验结果。结果 Gelred 染色的胶块晰晰度最好，EB 次之，均高于GoldView； Gelred 染色的图谱，相邻条带边缘清晰，更容易辨别区分。EB 和 GoldView 染色后必须脱色，使用 Gelred染色脱色时间较短，亦可以不经过脱色步骤，但脱色后的电泳条带边缘更加锐利。结论 Gelred是一种更安全、更灵敏的核酸染料，可以取代 EB 应用于 PFGE。制定了使用 Gelred 进行 PFGE 染胶的标准方案，用于 PulseNet China网络的 PFGE 分析。 关键词： PFGE；核酸染斗；安全 中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1003-9961(2011)05-0388-04 Comparative analysis of three types of nucleic acid staining for PFGE LOU Jing， DIAO Bao-wei， LI Wei， CUI Zhi- gang， KAN Biao. State Key Laboratory for Disease Prevention and Control， National Institute for Communicable DiseasePrevention and Control， Chinese Center for Disease Prevention and Control， Beijing 102206， China Corresponding author：KAN Biao， Email：kanbiao@ icdc. cn Abstract： Objective To compare the safety and sensitivity of three dyes， including Gelred，GoldView and Ethidiumbromide (EB)， used as nucleic acid staining reagents in pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for pathogens， andoptimize and standardize the protocol of the molecular typing surveillance network of pathogens-PulseNet China.Methods Vibrio cholera isolates were selected for evaluation purpose. PFGE was carried out according to the standardprotocol on molecular typing surveillance network (PulseNet). The agarose gels after electrophoresis were stained byGelred， GoldView and EB， respectively. The staining effects were observed. Results It is showed that the stainingeffect of Gelred was best among the three tested dyes. The observed DNA bands in the gels stained by Gelred is mostclear， followed by EB and GoldView. The band edge showed by Gelred staining was more clear and distinguishable. Itwould take time for gels to be destained after EB and GoldView staining， but if Gelred is used， the destaining time couldbe shortened or be neglected. Even though， it is noticeable that the edge of destained electrophoretic band after Gelredstaining would be more clear. Conclusion The results suggested that Gelred as a nucleic acid staining dye is safer andmore sensitive for gel viewing in PFGE procedure， and is promising to replace EB to develop PFGE standard protocol inPulseNet China network. Key words： PFGE； nucleic acid staining dye； safe The study was supported by state important scientific and technological project (No. 2008ZX10004-008) ( 基金项目：国家科技重大专项(No.2008ZX10004-008) ) ( 作者单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206 ) ( 作者简介：娄静，女，山西省陵川县人，硕士研究生，主要从事霍乱等病原体的分子分型研究工作 刁保卫，北京市人，主要从事霍乱等病原体的分子分型研 究工作 ) ( 通信作者：阐飙，Tel：010-58900703， Emai ： kanbiao@ icdc. cn ) ( 娄静和刁保卫对本文同等贡献，同为第一作者 ) 胶电泳(PFGE)从核酸序列方面描述病原菌的差异，分辨力较高，重复性好，已广泛应用于多种细菌的分型研究与分析1-31。。基于当前细菌性传染病的传播特征及公共卫生威胁，由美国疾病预防控制中心首先发起，建立了以 PFGE 为核心技术的实验室分子分型监测网络——PulseNet。该网络利用严格标准化的操作，通过网络实验室的检测分析和相互间带型的比对，建立数据交流的网络平台，有助于追溯暴发来源，确定传播途径和流行范围，发现传染病的跨地区和国际间的传播，已经成功预警和处 置了多起食源性传染病暴发疫情，成为疾病监测工作中的重要工具[4，5]0 1.1 实验菌株 PFGE 分子质量标准菌株为Salmonella Braenderup H9812，两株霍乱弧菌分别为VC2005029 和VC1986776。霍乱菌株 VC2005029和 VC1986776，PFGE条带相比其他菌株更为密集，条带数目较多，能够更加有效区分 PFGE 实验效果。 1材料与方法 1.2 实验仪器 脉冲场电泳仪 CHEF-Mapper( Bio-Rad)；读胶仪 Gel DocXR(Bio-Rad)；低温冰箱、离心机、振荡器、水浴箱、水浴摇床、菌液浊度测定仪。 1.3 PFGE方法 将所选3株菌株按照霍乱弧菌PFGE 标准操作方案制备电泳样本，同时制备3份。将3份相同菌株的电泳样本同时在一块凝胶中进行电泳，电泳参数为2~10 s，13 h；20 ~25 s，6 h。 电泳结束后，将凝胶按相同的电泳样本切割为3 份，同时采用 GoldView、Gelred EB 三种染料染色。染色方法分别按照3种染料的最优条件进行。染色步骤结束后，读取图像，比较分析结果。 1.4三种染料使用方法GelRed(美国 Biotium 公司)染色方法：取150 p.l GelRed 染料溶于500 ml 含有0.1 mol/L NaCl 的缓冲液中配制成染色液，将电泳后的凝胶放入染色液中染色30 min，再将凝胶用纯水漂洗或脱色30 min 后用凝胶成像仪获取图像。根据 Gelred 说明书，脱色步骤可以省略。 EB(美国 Sigma 公司)染色方法：取50 ul EB 储 存液(10 mg/ml)溶于 500 ml纯水中配制成染色液，将电泳后的凝胶放入染色液中染色 30 min，再将凝胶用纯水脱色60~90 min(每20~30 min 换1次纯水)后用凝胶成像仪获取图像。 GoldView(赛百盛公司)染色方法：取25 plGoldView 染料溶于500 ml纯水中配制成染色液，将电泳后的凝胶放入染色液中染色 30 min，再将凝胶用纯水脱色60~90 min(每20~30 min 换1次纯水)后用凝胶成像仪获取图像。 目前，PFGE 使用的染色剂为溴化乙锭(EB)，EB目前是分子生物学实验中常用的染料16J，大量文献报道，包括果蝇、小鼠等的实验均证实小剂量的 EB 亦存在致突变、抑制细胞生长等问题7，8]，长期使用极有可能对操作人员造成危害。废液处理也存在生物安全隐患，污染环境。因此实验结束后，应对含EB 的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置，以避免污染环境19，10]。有报道 GoldView的毒性低于 EB，但仍然具有相当的毒：性11。而Gelred 的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，从而降低了染料的细胞毒性，更加安全12。我们已在中国建立了 PulseNet 实验室网络，为了在PFGE方法中寻找灵敏和安全的核酸染料，笔者对 2.1三三种染料对 PFGE 凝胶的染色结果 对同-此3种染料染胶效果进行了比较分析。确定能够 块凝胶上的霍乱弧菌菌株以及用作分子质量标准保证实验结果的更为安全的染料替代 EB，更好的 的沙门菌菌株，在切割成3份后，每份凝胶分别用保证操作人员的健康和周围环境的安全，并形成 Gelred、GoldView 和EB三种染料按照上述方法分别标准化操作方案。 染色，经成像仪读胶结果见图1。目测和能够被BioNumerics 软件识别的3种染料 PFGE 条带数、在3种染料染色中有不同，其中作为分子质量标准的沙门菌 H9812条带数是相同的，但受试的霍乱弧菌菌株条带数不同，以 Gelred 染色条带最多，见表1。 1.5 PFGE 条带亮度比较 选择3种染料染色的分子质量标准菌株 H9812 的 PFGE 图谱，利用 Photoshop8.0.1软件对 H9812电泳条带亮度值进行比较。 2 结果及讨论 注：M：分子质量标准示 H9812；1：霍乱弧菌VC2005029；2：霍乱弧菌 VC1986776。 图1 Gelred、GoldView 和 EB三种染料 PFGE染色结果对比 Figure 1(Comparison of Gelred， GoldViewand EB staining in PFGE 表1 不同染料 PFGE 清晰条带数目对比 Table 1 Numbers of clear bands in PFGE by different dyes 染料 H9812 VC2005029 VC1986776 H9812 (泳道M) (泳道1) (泳道2) (泳道M) Gelred 19 30 28 19 GoldView 19 30 28 19 EB 25 24 灵敏性、安全性、时间成本及染料的稳定性等是评价染料优劣的指标13，14。。能够清晰呈现更多的条带，并且条带边缘清晰、对比鲜明，相邻条带之间界限清楚，更易于辨认区分，是衡量该方法分辨率的主要标准。从图1可见， Gelred 染色的胶块清晰度最好，EB次之，均高于GoldView； Gelred 染色的图谱，相邻条带边缘清晰，更容易辨别区分；从表1中我们可以看到，经Gelred 染色的胶块，条带的数目与 GoldView 相同，多于EB 染色的胶块。 2.2凝胶染色后脱色对图像清晰度的影响 使用GoldView 和EB染色，的色的步骤是重要和必须的。不经过脱色步骤，图像效果很差，根本不能用于PFGE 分析。脱色步骤要求，以500 ml纯水脱色60~90 min，如果可能每20~30 min 换一次纯水。而根据 Gelred 说明书，染胶后只需脱色 30 min，亦可以不进行脱色的步骤，同样有很好的电泳图谱。在本次分析中也发现这个结果。为建立最优的PFGE 标准操作方案，我们对 Gelred 脱色和不脱色的结果进行了比较。 注：M：分子质量标准株 H9812；1：霍乱弧菌VC2005029；2：霍乱弧菌VC1986776 图2 Gelred 染色后不脱色与脱色结果对比 Figure 2 Comparison of PFGE results with destaining andwithout destaining after Gelred staining 使用 Gelred 染色后，未脱色的图像从电泳条带的数目、条带的清晰度与脱色后的条带无显著区别，但脱色后的电泳条带边缘更加锐利，因此，使用Gelred 进行染色时，为获得最佳结果，仍推荐使用脱 色30 min 的方案。 2.3 三种染料染色条带亮度比较 选择3种染料染色的分子质量标准菌株 H9812 的 PFGE 图谱，利用 Photoshop 8.0.1软件对 H9812电泳条带亮度值进行比较，结果见图3。横坐标表示 H9812 的19个条滞，纵坐标为条带亮度值，数值越高表示该条带亮度越高，蓝色条带为 Gelred，红色和绿色分别为GoldView 和EB。从图3可以看出 H9812 的19个条带的亮度值，染料染色亮度从高至低依次为Gelred、EB 和 GoldView， Gelred 染色的条带亮度值范围是14~100，EB 是11~43，GoldView 为9~20。使用 SPSS 16.0统计分析的结果：Shapiro-Wilk 检验显示，在0.05检验水准下， Gelred 和EB组数据来自非正态分布的总体(P=0.008，P=0.001)，因此采用多个相关样本的秩和检验，x²=35.351，P<0.001，说明不同染料染色 PFGE 各条带亮度值差异有统计学意义，根据 Gelred 的平均秩次(3.00)大于EB(1.89)和 GoldView(1.11)，可知 Gelred 的染色亮度最高。 图3 H9812 不同染料染色 PFGE各条带亮度值比较 Figure 3 Comparison of brightness values PFEG bandsof H9812 by different staining 另外，在使用凝胶成像仪读取电泳图像时，Gelred 染色胶块的曝光时间为0.812 s，而 GoldView和 EB染色胶块的曝光时间分别为4.287s 和2.560 s，也说明 Gelred 灵敏度要明显强于 GoldView和 EB。 3 结论 通过对比 Gelred、GoldView 和EB三种核酸染料， Gelred 在条带数目、清晰程度、条带亮度及相邻条带的区分能力都明显优于 GoldView和EB。而且脱色时间短，降低了实验的时间成本。另外 Gelred性质稳定，常温可长期保存。更为重要的是 Gelred的安全性要明显优于 GoldView 和EB，能够最大程度保护操作人员及周围环境121. 基于以上分析，最终确定PFGE 染胶使用 Gelred，染色标准程序为：150 ul Gelred 染料溶于500 ml含有0.1 mol/L NaCl 的缓冲液中配制成染色液，将电泳后的凝胶放入染色液中染色30 min，纯水脱色 30 min 后用凝胶成像仪获取图像。我们将按照该程序使用 Gelred 替换 EB 染色，推荐应用于PulseNet China 监测网络 PFGE 的标准操作。 ( 参考文献 ) ( [1] Struele n s M . 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