淀粉中顺反式丁烯二酸检测方案

2 3 HPLC-UV 同时测定淀粉中的顺反式丁烯二酸 曾明飞金燕梁立娜 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 引言 顺丁烯二酸 (HO2CCH=CHC02H)，又称“马来酸”，为最简单的不饱和二元羧酸，属于树脂等化学黏合剂原料，主要用在工业粘着剂中，但若加入食物中可增加食物弹性及保质期。长期超标食用含顺丁烯二酸食品，将极大损伤人体肾脏功能，甚至引发不孕不育。 “毒淀粉”事件的曝光源自2013年3月，台湾地区嘉义 县调查站接获检举称，在食物中发现含顺丁烯二酸(酐)的有毒淀粉。这次“毒淀粉”事件被台湾媒体称为继2011年“塑化剂”事件后台湾地区食品安全领域面临的最大危机。顺丁烯二酸与反丁烯二酸(又称“富马酸”)互为几何异构体，其中反丁烯二酸是可以作为食品添加剂应用于食品中的，主要起酸度调节剂的作用，食品添加剂卫生标准(GB2760-2011)允许添加的食品添加剂目录中可以查询到该物质。而顺丁烯二酸(酐)并未收入允许添加的食品添加剂目录，并且目前在大陆地区食品添加剂检测中也暂无对该物质的相关检测规定。但食品专家指出，顺丁烯二酸(酐)在大陆食品领域可能存在一定滥用现象，成本低廉是商家使用顺丁烯二酸(酐)作为食品添加剂的主要动因。为了增加食物的弹性、黏性及外观光亮度，淀粉成为添加顺丁烯二酸(酐)的高危对象。因此，本应用建立了一种测定淀粉中顺丁烯二酸(酐)的方法，以满足食品安全监控的迫切需求。 液相色谱法(HPLC-UV) 具有快速、高效、操作简便等优点，并且随着科技的发展固定相粒度向更小发展，柱效提高了2~3个数量级，分离速度也大大提高。现行国家标准GB/T 23296.21-2009 即是采用高效液相色谱法对食品模拟物 中顺丁烯二酸(酐)进行分离与测定。有关文献-3及国家标准 GB/T 23296.21-2009均采用 C18色谱柱、磷缓缓冲盐流动相检测食品中的顺丁烯二酸。本文采用 HPLC-UV 方法同时分析了马来酸和富马酸，方法简单快速，灵敏度高(LOQ为 0.01 ug/mL)， 峰型对称尖锐，基线分离，与已发表文献相比具有相当的优越性，易推广应用到实际样品的测定中。 仪器配置 Thermo Ultimate 3000 系统： 泵： LPG-3400 1自动进样器： WPS-3000 柱温箱： TCC-3000 检测器： DAD-3000 色谱软件： Chromeleon 7. 色谱柱： Acclaim C18， 4.6 mmx250 mm， 5 um (S/N004732，P/N059149) 流动相：0.1%磷酸水溶液：0.1%磷酸甲醇溶液95：5流速：1.0mL/min 分析时间：10min 检测器波长：220nm 进样量：20pL 柱温：30℃ 分别精密称量顺丁烯二酸(马来酸 Maleic acid)， 反丁烯二酸(富马酸 Fumaric acid) 对照品各5.0 mg于50mL容量瓶中， 加入去离子水溶解，定容至刻度处，混匀，得到100 pg/mL的马来酸和富马酸混合标准母液。母液用5%的乙醇水溶液逐豕稀释后，得到一系列浓度的标准工作溶液(0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 pg/mL)。 马来酸和富马酸结构如 Fig 1. 0 Fig 1. 马来酸和富马酸的结构式 分数5%的乙醇水溶液，涡旋2 min， 放入超声波水浴中超声震荡15 min取出，用5%的乙醇水溶液定容至刻度处，涡旋混匀，然后13，000 rpm 离心 10 min 后，取上清液，过0.22 pm尼龙滤膜，弃去初滤液3mL，续滤液直接进样分析。 结果和讨论 专属性、线性、灵敏度、精密度实验 经 HPLC 分析后，以马来酸和富马酸的峰面积(Y)对其质量浓度 (X)建立标准工作曲线，结果显示二者在 0.01-2.0 ug/ml线性范围内结果良好，如Tab 1所示。马来酸和富马酸保留时间附近没有干扰峰，且最低定量限浓度 (LOQ) (S/N> 10) 0.01pg/mL连续进样5次，精密度分别为4.81%，6.60%，如Fig 2A 和B所示。 A. 空白溶液，富马酸、马来酸标准品溶液比较(其中1为空白溶剂，2为0.2ppm的标准品) B.LOQ标准品溶液与重现性(0.01pg/mL) Fig 2.标准溶液的 HPLC 色谱图 Tab 1.马来酸和富马酸标准曲线方程 分析物 RT Cal.Type Points 相关系数 C0 C1 线性范围 min (Offset) Slope) (ug/mL) 马来酸 5.78 Lin Off 7 0.99993 0.0163 1.9153 0.01-2.0 富马酸 6.93 Lin Off 7 0.99998 0.0114 1.9455 0.01-2.0 分别取低浓度，中浓度，高浓度的混标溶液，连续进样5次。精密度结果如 Tab 2.低、中、高浓度的精密度均在2%以内。结果良好。 实际样品分析及加标回收 适量称取购得的淀粉样品，添加一定量的马来酸和富马酸标准品考察加标回收率。按照选定的样品前处理方法进行 处理，按照建立的色谱条件进行测定，外标法定量。在实际淀粉样品中未检出含有马来酸与富马酸，而两个面粉样品中均检出一定量的富马酸，结果如 Tab3 所示。在其中一个淀粉样品中分别添加低、中、高含量的马来酸和富马酸混标溶液，然后按照样品前处理方法进行处理，不同浓度两种有机酸的加标回收率在 88%-102%， 如下 Tab4 所示。 fab 3.实际样品检测结果(n=2) 样品 马来酸 (ug/g) 富马酸(ug/g) 淀粉A ND* ND 淀粉B ND ND 面粉A ND 49.30 52.91 ND： No Detect Tab 4.马来酸和富马酸加标回收率结果(n=5) 理论浓度 马来酸 富马酸 (pg/mL) 测定浓度(ug/mL) 回收率(%) 测定浓度 (ug/mL) 回收率(%) 0.04 0.0397 99 0.0350 88 0.16 0.1609 101 0.1635 102 1.60 1.5952 100 1.5968 100 A.淀粉样品A及淀粉样品A加标(其中1为淀粉，2为淀粉加标) B.面粉样品 Fig3.样品 HPLC图谱 A.样品中富马酸光谱图 Fig 4.样品与标准品中富马酸光谱图对比 本方法采用 HPLC-UV 对淀粉中马来酸和富马酸同时进行了检测。马来酸和富马酸均为强极性，市场上有报道采用HILIC 方法模式检测，但未见保留效果优于C18，并且相关国家标准 GB/T 23296.21-2009 和参考文献13均采用 C18色谱柱，本方法中 Acclaim C18 色谱柱，0.1%磷酸溶液，使马来酸和富马酸能够同时保留，分离度良好，与样品中杂质能够基线分离。考察空白溶液和空白样品中的专属性，表明没有存在杂质干扰。如 Fig 3中，样品与标准品溶液中相同保留时间 (RT 6.93 min) 的色谱峰光谱图对比，结果完全一致，从而确认该成分为富马酸。对于波长的选择，马来酸 和富马酸最大吸收波长在210nm， 但此波长样品存在干扰，因此最终选择220 nm 做为检测波长。标准溶液线性范围为0.01-2.0 ug/mL， LOQ 为 0.01 ug/mL。采用超声前处理方法，与其他前处理和检测方法相比，分析效率高，操作简单，灵敏度高，试验成本低。考虑在实际样品中淀粉基质的干扰，通过空白样品加标试验表明即使在淀粉基质中该方法也能获得较高的信噪比，按照 S/N>10 的要求， LOQ 仍然能达到 0.03 pg/mL。因此将本方法应用于食品安全监测领域，具有很高的实用价值。 ( [1]李红艳，陈万勤，王瑾，张水锋，沈潇冰，邵亮亮， 刘柱，陈小珍.高效液相色谱法测定淀粉及淀粉制品中的顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总含量.[J]分析测试 学报，20 1 2，31 ( 8)：127-130 ) ( [2]李金昶，王广，崔秀君，赫奕，孙颜.用反相高效液相色谱法分离和测定丁烯二酸的顺反异反体.[J]分析 测试学报，201 2 ，19( 2 )：72-74. ) ( [3]李康乐，吴梧桐，宋祥珍，高松梅.高效液相色谱法同 时测定药用苹果酸中的马来酸与富马酸.[J]中国药科 大学学报，1994，25(2)：106-108. ) ( [4] 中华人民共和国国家标准.GBT23296.21-2009 食品接触 材料高分子材料食品模拟物中顺丁烯二酸及顺丁烯二 酸酐的测定高效液相色谱法，2009. ) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-