测定血清中21种元素的前处理方法研究

目的:采用电感耦合等离子体质谱技术，测定血清中21种元素含量，重点优化血清中多元素测定的样品前处理方法。方法:采用1%硝酸，1% TtitonX-100，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸铵与1%乙醇混合溶剂稀释血清样品20倍后，进入ICP-MS 仪器检测 Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo、Sb、Fe、Cu、Zn、Se、Al、As、Sr、Pb、Sn 和 Cr 21 种元素的含量。结果:血清中21种元素在线性范围内线性良好（r＞0.995）；检出限为0.14～15.90 μg/L。方法用于孕妇血清样本检测，低高浓度2个水平的血清加标回收率为82.2%～121.5%，相对标准偏差小于10%。采集639名孕妇血清样本进行检测，21种元素中除Tl、W、La、Ce、Hg ，其余元素均有检出。结论:通过条件优化，采用混合溶剂稀释法联合ICP-MS对血清中21种金属元素分析，方法快速、简便、准确，适宜用于评估人体元素暴露水平。目前发现的金属元素有80余种，人体中含有60余种，其中占人体总质量0.01%的微量元素有20余种如铁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、镍、钼、锡等，虽然在人体内的含量较低，但它们是构成细胞结构必不可少的成分，在人体代谢和生理过程中发挥着重要作用；还有一些重金属元素不是生命活动所必须，且超过一定浓度都对人体有毒如镉、铅、砷、汞等。人体可通过食品、饮水、空气等摄入元素，为了准确高效的监测人体元素暴露水平，评估其健康效应，建立血清中多元素同时分析方法是必要的。虽然目前多元素检测的方法已较成熟，在常用的原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法和电感耦合等 离子体质谱法（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）中，ICP-MS法的宽线性范 围、高灵敏度和强抗干扰能力，使其在多元素分析 中具有不可比拟的优势，应用范围越来越广，尤其 在生物样品检测中，ICP炬焰的超高温，使得样品经 简单处理也能获得满意的效果。不同的元素在体内的存在形态不同，溶出所需条件亦有差异，虽 已有 ICP-MS 测定血清元素的诸多报道，但笔者在 实验中发现，样品前处理的不同会带来极大的影 响，要兼顾各元素分析，获得灵敏准确的结果尚属不易。因此本文通过重点优化血清样品前处理条件，选择21种常见金属元素进行ICP-MS分析，构 建出一种快速、准确的检测方式，并用于孕妇血清样品的批量分析。材料与方法材料: 样品来源于临床检验样品，血样采集后进行血清分离，将血清分装并放入冻存盒中，于－80 ℃冰箱保存。仪器: 电感耦合等离子体质谱仪(上海美析仪器有限公司)标准品和试剂：购自国家有色金属及电子材料分析测试中心的21种待测元素标准溶液55 Mn、59 Co、60 Ni、111 Cd、139 La、140 Ce、182 W、201 Hg、204 Tl、96 Mo、122 Sb、56 Fe、64 Cu、66 Zn、78 Se、27 Al、75 As、88 Sr、208 Pb、118 Sn和52 Cr，浓度1000 μg/mL。5种内标元素标准溶液：45 Sc、72 Ge、115 In、159 Tb和209 Bi，自国家有色金属及电子材料分析测试中心购入，浓度为1 000 μg/mL。硝酸（BV-III 级），购自北京化学试剂研究所。Triton X-100（LR级），购自Sigma-Aldrich公司。乙醇和四甲基氢氧化铵均为分析纯。实验方法ICP-MS仪器条件：通过自动调谐和优化，确定ICP-MS 条件为：射频功率1550W，载气流速 1.05 L/min，采样深度 8.0 mm，雾化器泵速 0.10 rps， 雾化室温度2 ℃，提取透镜－200.0 V；四级杆偏转电 压－3.0 V；八级杆射频功率150 V，能量歧视5.0 V。 各元素均选择He模式进行测定，八级杆碰撞池He 气流速1.0 L/min。样品稀释剂配制：实验采用1%硝酸（BV Ⅲ级）溶液，1%TtitonX-100 溶液，0.01%吡咯烷二硫 代氨基甲酸铵与 1%乙醇混合作为样品稀释剂。 具体配制方法：以配制 1 000 mL稀释剂为例，加入 硝酸 10 mL，曲拉通 X-100 0.5g，吡咯烷二硫代氨 基甲酸铵 0.10g，乙醇10mL，用纯水溶解并定容至1000mL，充分混匀后置4 ℃保存。标准溶液配制和标准曲线制定 参考21种 元素在血清中的浓度，分为3个浓度系列配制标准 应用液，其中Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和Sb为同一系列浓度，元素应用液浓度为40 μg/L； As、Sr、Pb、Sn、Cr为同一系列浓度，元素应用液浓度 为100μg/L；Fe、Cu、Zn、Se和Al为同一系列浓度，元素应用液浓度为1000μg/L。分别吸取混合标准应用液 0μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1 000μL，定容至10mL，配制成标准系列浓度：Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和 Sb 标准系列浓度为 0μg/L、0.20μg/L、0.40μg/L、0.80μg/L、2.00μg/L、4.00μg/L；As、Sr、Pb、Sn和Cr标准系列浓度为0μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、10.00μg/L；Fe、Cu、Zn、Se 和 Al 标准系列浓度为0μg/L、5.00μg/L、10.00μg/L、20.00μg/L、50.00μg/L、100.00μg/L。将上述标准系列溶液注入ICP-MS中进行分 析，以各待测元素浓度为横坐标，各待测元素与相应内标元素的响应值比值为纵坐标，绘制标准曲线。选择与待测元素原子量接近的内标进行相应的校正。方法学验证 从灵敏度（检出限）、精密度（相 对标准偏差）和准确度（回收率）3方面进行方法学 验证，以考察方法性能，数据分析通过 Excel 2007 进行计算。通过平行测定混合血清10次，以测定值 的 3 倍和 10 倍标准差对应的浓度计算检出限 （LODs）和定量限（LOQs）；吸取混合血清样品9份， 其中 3 份用于测定本底值，另取 6 份分别加入定量 限和 2 倍定量限水平的标准溶液，在 1 日内重复测 定6次和6日内重复测定21种元素的含量，计算测 得值的相对标准偏差值（RSDs）和加标回收率。样品分析 采集血样后分离血清，将血清分装于0.5mL离心管内，编号并放入冻存盒内，－80 ℃冰 箱保存。实验前取出于室温下解冻。吸取100μL血清样品于5mL塑料离心管中，加入稀释剂：1%硝酸 （BV Ⅲ级）溶液，1%TtitonX-100溶液，0.01%吡咯烷 二硫代氨基甲酸铵与1%乙醇直接稀释20倍，涡旋 混匀，10 000 r/min离心2 min，取上清进样分析。质 控血清以同样方式进行处理。样品分析的质量控制 每批次上机前和每测30个样品后进行质控检测，包括程序空白、平行样和质控样品。程序空白实验是指前处理过程中，除不加样品外，其他步骤同1.3样品分析，用于监测整个实验分析阶段中待测元素的干扰，若在进样液中检出待测元素，则需排除原因后重新测定。平行样指对同一血样进行相同的处理和分析，2次检测结果差值应不超过平均值的10%，否则需排除原因后重新分析。ClinChek微量元素质控样检测，测得值与标准值的相对偏差均在参考值范围内。ICP-MS 测定模式选择 采用碰撞反应模式（He）和标准模式（No gas）考察了ICP-MS的测定模式，通过加标样品分析，各元素在He模式下的回收率均优于 No gas 模式，回收率在 80%～120%范围内。因此实验选择在He模式下进行测定。样品前处理方式优化直接稀释法与微波消解法的比较 ICP-MS测定时常用的样品前处理方式有微波消解法和直接稀释法。消解法对有机物的消解能力强，能更有效降低样品的基质效应，但操作相对繁琐，消解过程中待测元素易受到污染和损失。ICP-MS采用超高温的ICP炬焰，对物质进行离子化的同时，也可使样品基质高温下彻底灰化，因此一些液态样品经过简单的处理如稀释、过滤等，即可引入仪器进行元素测定。实验比较了直接稀释法和微波消解法的加标样品回收率，结果表明采用消解法，Al、Pb等元素空白值偏高（＞2.0 μg/L）且相对标准偏差大（15%～30%），并且由于加热赶酸会造成Hg元素损失，回收率偏低（低于70%）；直接稀释法的元素回收率均较为理想（高于80%），空白可以得到有效控制。因此，实验选择直接稀释法进行样品处理，并进一步优化了稀释剂组合和稀释倍数。稀释剂选择 稀释溶剂一般使用水和一定浓度的硝酸，为了提高测定灵敏度，可加入非离子性表面活性剂或有机试剂如曲拉通X-100、乙醇，以及金属络合剂如吡咯烷二硫代氨基甲酸铵，同时防止未溶解的生物蛋白物质堵塞 ICP-MS 雾化系统。与酸性稀释剂相比，碱性稀释剂如四甲基氢氧化铵，可减少酸度对ICP-MS的干扰，又可以快速消除记忆效应。综上，参考美国疾病预防控制中心测定标准（DLS 3016.8. Blood Metals Panel 2 （BMP2）ICP-DRC-MS.）和中国团体标准（T/WSJD 19.1—2021，全血中 23 种元素的电感耦合等离子体质谱法），实验拟采用 1%硝酸溶液、0.05%Triton-100、0.01%吡咯烷二硫代氨基甲酸铵、1.0%，v/v 四甲基氢氧化铵、1%乙醇作为稀释溶剂，并采取以下4 种组合方式进行实验，选取最优稀释剂组合。方法①：四甲基氢氧化铵（1.0%，v/v）＋曲拉通 X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）；方法②：曲拉通X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）（色谱纯为佳）＋硝酸（1.0%，v/v）；方法③：曲拉通 X100（0.05%）＋硝酸（1.0%，v/v）＋吡咯烷二硫代氨基 甲酸铵（0.01%）；方法④：曲拉通X-100（0.05%）＋硝 酸（1.0%，v/v）＋乙醇（1%，v/v）。经过几种组合的比对，实验结果显示，硝酸的加入可以显著提高 Al、Ni 2 种元素的线性，以及Cu、Sn、La、Ce 的回收率（从＜60%增至＞75%），说明这几种元素在硝酸介质中不易降解或沉淀损失，更易溶出；吡咯烷二硫代氨基甲酸铵加入可以显著提高Sn、La、Ce的回收率（从＜40%增至＞88%），说明吡咯烷二硫代氨基甲酸铵可提高这几种元素的溶出；乙醇的加入可使得As的回收率好转，且能有效提高大多元素的响应值（1.1～1.5 倍）；四甲基氢氧化铵的添加会造成 Al、Cu、La、Ce 等元素回收率下降，可能是碱性条件下容易发生沉淀造成损失，对其余各元素影响甚小。综合各元素回收率的情况，实验最终选取稀释剂组合为：1%硝酸，0.05%TrtionX-100 溶液，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸铵，1%乙醇。稀释倍数 随机抽取10份血清样品混合，优化的稀释剂，在10～30倍范围内对稀释倍数进行了考察。由于血清粘度较大、基质较复杂，采用较低稀释倍数时，容易堵塞进样毛细管，对部分元素尤其是样品中低含量的元素分析产生干扰，使其测定的精密（＞20%）和回收率较低（40%～60%），但稀释倍数太高又会导致一些元素分析灵敏度低。综合考虑回收率和灵敏度，实验最终选择血 清样品稀释20倍，离心后进样分析。讨论检测模式和样品前处理方式 实验比较了 ICP-MS 在 2 种模式下（He模式/No Gas 模式）各种 元素的测定结果，考虑到元素的线性回归以及加标 回收率，在前者模式下各种元素有更好的结果呈现， 因此实验选择了在He模式下进行元素测定。这基于He模式可以有效消除多原子离子干扰，是ICP-MS测定的基本原理，在此不再赘述。 实验重点考察了血清样品前处理方式，采用 消解法与直接稀释法对血清样品进行前处理。与 文献报道一致，消解法可以彻底的除去血清中的 有机基质，取得良好的回收率，但挥发性元素的挥 发损失、消解后的赶酸过程以及因赶酸不彻底带来的酸度干扰，均会使操作更为繁琐或降低方法的准确度。