生物细胞中RNA质量检测方案(超微量分光光度计)

上海美析仪器有限公司美析仪器 RNA 质量检测方案(超微量紫外分光) 简介核糖核酸(缩写为 RNA， 即 RibonucleicAcid)， 存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了 DNA 中的T。 原理细胞中的RNA可以分为信使 RNA、转运 RNA 和核糖体 RNA 三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白， DNA等杂质，最终获得高纯度 RNA 产物的过程。 仪器及试剂 UL-1000 超微量可见分光光度计 离心管离心机 电泳槽凝胶板 细胞样品 RNA 提取试剂盒荧光定量 PCR Mix TRIZOL dNTP 氯仿 逆转录酶MMLV 异丙醇 Taq 酶 DEPC水 ddH2O TE MgCI2琼脂糖溴化乙锭 MOPS甲醛乙酸钠 EDTAEB 溴酚兰 样品 RNA 的抽提 1.取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 2.两相分离每1ml 的 TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后， 15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000 rpm 离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。 3.).RNA沉淀将水相上层转移移一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA， 混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 4.F.RNA清洗移去上清液，每1mITRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml 的75%乙醇(75%乙醇用 DEPCH2O配制)，清洗 RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000 rpm 离心5分钟。 5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 6.).溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无 RNA 酶的水40ul用枪反复吹打几次，使其完全 溶解，获得的RNA 溶液保存于-80℃待用。 RNA 质量检测 紫外吸收法测定 先用稀释用的 TE 溶液将紫外分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释(1：100) 后，读取其在分光光度计260nm 和280nm处的吸收值，测定 RNA溶液浓度和纯度。 (1)浓度测定 A260 下读值为1表示 40 ug RNA/ml。样品 RNA 浓度(&mu；g/ml)计算公式为： A260x稀释倍数x40ug/ml。具体计算如下： RNA 溶于 40 ul DEPC水中，取 5 ul， 1：100 稀释至495 ul 的 TE 中， 测得A260=0.21RNA 浓度=0.21x100x40 ug/ml=840 ug/ml 或 0.84 ug/ul 取5ul用来测量以后，剩余样品 RNA 为 35ul， 剩余 RNA总量为：35 ulx0.84 ug/ul= 29.4 ug (2)纯度检测 RNA 溶液的 A260/A280的比值即为 RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2..变性琼脂糖凝胶电泳测定 (1)制胶 1g琼脂糖溶于72 ml 水中，冷却至60℃， 10 ml 的 10 xMOPS 电泳缓冲液和18 ml 的37%甲醛溶液(12.3M)。 10x MOPS 电泳缓冲液 浓度 成分 0.4M MOPS， pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01MEDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25&mu；l 溶液。凝凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 (2)准备RNA品 取 3 ugRNA， 加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为 10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 (3))E电泳 上样前凝胶须预电泳5 min， 随后将样品加入上样孔。5-6V/cm 电压下2h，，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。 (4)紫外透射光下观察并拍照 28S 和18S核糖体 RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型)，)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的 RNA (tRNA和5S核糖体RNA)组成。在 18S 和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质 可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果出现 DNA污染，，将会在28S 核糖体 RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，FRNA的降解表现为核糖体 RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 结果计算 RNA 得率有很强的组织特异性，不同组织 RNA 的丰度和 RNA 提取的易难程度共同决定了该种组织的 RNA 得率。一般来说， T可通过分光光度计测定 RNA 溶液在 260nm 处的吸光值来计算 RNA 的含量。RNA 夜液在260、320、230、280nm 下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm 处， 1ug/mIRNA钠吸光度0.025(光程为1cm)， 即OD260=1时，样品中RNA 浓度为 40ug/ml。通常分光光度计 OD260 的读数要介于 0.15-1.0之间才是可靠的。因此 RNA 提取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计检测。按下面的共识计算总 RNA 浓度： 总RNA 浓度 (ug/ml) =OD260×稀释倍数x40ug/ml 仪器参数 UL-1000 超微量紫外可见分光光度计产品参数 1.产品简介 超微量紫外可见分光光度计是一类很重要的分析仪器，无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域，还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门，超微量紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。超微量紫外可见分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。超微量紫外可见分光光度计已成为现代分子生物实验室常规仪器。 2.仪器特点 *检测所需样微量，最低只需0.5ul *检测范围宽，比传统的分光光度计的上限高100倍 *对于多数样品而言，无需稀释 *机器无需预热，直接测量，无需检测容器，日常消耗低 *全波长190-1100nm，分辨率1nm， 仪器都自动给出全波长的扫描结果190-850nm *体积小巧，便携式包装，满足现场检测的需求 *通过 PC 控制实现更精确和灵活的测量 3.技术指标 *最小样本量：0.5ul *光程：1mm/0.2mm *波长范围：190~850nm *波长精度：1nm *波长分辨率：： ≤0.3nm (FWHM 在 Hg 253.7nm) *吸光率精度：2%(0.76在257nm) *吸光率分辨精度： 0.002Abs (1mm 光程) *吸光率范围：0.02~300(等效10mm 光程) *可准确测量范围：0.1~5Abs.±0.1Abs 5~80 Abs. ±2% *侦测器：3648像素线性 CCD 阵列 *光源：微型氙气闪光灯系统 *测量时间：<5秒 *尺寸：200mm×130mm×136mm (LxWxH) *重量：：≤2.0kg *样本检测平台材质：304不锈钢和石英 *输入电压： AC100~240V50-60Hz *操作电源功率： 24W 关于我们 上海美析仪器公司简介 上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技—-因你改变"，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。 美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原子荧光光度计、ICP电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户同时，20多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。 (美析仪器不仅仅只是一家高新技术认证企业，更通过了 CE 认证、FCC认证、RoHS 认证以及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等) TEL- 核糖核酸(缩写为RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。