双离子源-串联质谱法用于血清中7种脂溶性维生素含量测定

使用双离子源-三重四极杆液质联用系统建立了血清中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE、VK1、MK4及MK7同时测定方法，使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.994，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在90%~105%之间，RSD在1.4%~5.1%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于血清中脂溶性维生素含量测定。SSL-CA23-264Excellence in Science Excellence in Science 双离子源-串联质谱法用于血清中7种脂 溶性维生素含量测定 LCMSMS-800 摘要：使用双离子源-三重四极杆液质联用系统建立了血清中VA、250HVD2、250HVD3、VE、VK1、MK4及 MK7 同时测定方法，使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该 方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.994，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在90%~108%之间， RSD 在1.4%~5.1%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于人体脂溶性 维生素含量测定。 关键词：三重四极杆液质联用系统 双离子源 脂溶性维生素 血清 技术特点： 心使用双离子源检测7种脂溶性维生素。 必一针法完成七种脂溶性维生素检测。 脂溶性维生素包括维生素A(VA)、维生素 D(VD)、维生素 E(VE) 和维生素K。维生素A缺乏引起夜盲 症、上皮干燥、增生及角化，眼干燥症等。维生素D 主要生理功能是将血钙和血磷水平维持在正常范围 内，对于维持钙的代谢和骨骼健康至关重要。血清 中25-羟基维生素 D2(250HVD2) 和25-羟基维生素 D3(250HVD3)的浓度测量，已经应用于监控人体内 维生素D的状况及低血钙代谢性骨疾病和高血钙代 谢性骨疾病的鉴别诊断。维生素E具有抗衰老、抗癌 及防止动脉粥样硬化作用，促进生殖功能使促性腺激 素分泌增加等。维生素K可分为维生素K1 及维生素 K2。维生素K1可以促进肝脏合成四种凝血因子，凝 血酶原、转变加速因子，抗血友病因子，促进血液凝 固等。维生素K2有多种活性形式，其中最常见的有 甲萘醌-4(MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)，其对骨骼健康 及心血管健康有重要作用。由于遇光遇热不稳定，且 血清中含有大量干扰物质等，血清中脂溶性维生素的 测定十分困难，一针法同时测定脂溶性维生素更是鲜 有报道。 双离子源 (DUIS 离子源)可同时进行两种离子化 (ESI和APCI)，并可同时对样品中不同极性组分同 时分析，扩大可检测样品极性范围。通常，使用ESI 离子源测定脂溶性维生素可以得到更优灵敏度，而使 用 APCI 离子源测定可以大幅降低基质干扰， DUIS 离 子源的应用可以兼备二者优点。 本文使用双离子源 (DUIS离子源)-串联质谱 LCMS-8060 NX，建立了血清中VA、250HVD2、25OHVD3、VE、VK1、MK4及MK7 同时测定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于脂溶性维生素含量测定。 1.1仪器 本实验使用双离子源(DUIS离子源)-串联质谱 LCMS-8060 NX。具体配置为： 系统控制器：CBM-40脱 气机：LDGU-405输 液 泵：LC-40DX3×2自动进样器：SSIL-40C X3柱温 箱：CTO-40C质谱检测器：LLCMS-8060 NX 色谱工作站：LLabSolutions Ver. 5.118 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：：Shim-pack GIST 50 mm×2.1 mm l.D.， 2 um； P/N： 227-30001-02； LCMSMS-800 流云动相：AA： 0.1%甲酸水(含2mM乙酸铵)B： 0.1%甲酸甲醇(含2mM乙酸铵) 流 速：0.5mL/min 进样量： 10 uL 柱 温：45°℃ 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为70%，洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.50 泵 B.Conc 70 2.50 泵 B.Conc 100 13.00 泵 B.Conc 100 13.10 泵 B.Conc 70 15.00 控制器 Stop 质谱条件 分析仪器：LLCCIMS-8060 NX DL 温度：150°℃ 离子源：DUIS(+) 加热模块温度：500°℃ 雾化气流速：3.0 L/min 离子源温度：300°℃ 干燥气流速：3.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气流速：20.0 L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 编号 中文名 英文缩写 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) 1 维生素A VA 269.2* 93.1 -30 -10 -17 269.2 119.2 -14 -21 -12 2 维生素A内标 VA-IS 275.2 96.1 -30 -10 -17 3 25-羟基维生素 D2 250HVD2 395.2* 269.2 -29 -20 -19 395.2 105.1 -11 -53 -11 4 25-羟基维生素 D2内标 250HVD2-IS 398.2 269.2 -29 -20 -19 5 250HVD3 383.2* 257.2 -18 -18 -30 25-羟基维生素 D3 383.2 107.1 -19 -29 -12 6 25-羟基维生素 D3内标 250HVD3-IS 389.2 263.2 -18 -18 -30 431.3* 165.1 -25 -55 -25 7 维生素E VE 431.3 137.1 -25 -30 -14 8 维生素E内标 VE-IS 437.3 171.1 -25 -55 -25 9 VK1 451.3* 187.1 -22 -24 -13 维生素K1 451.3 197.1 -22 -26 -21 10 维生素K1 内标 VK1-IS 458.3 194.1 -22 -24 -13 11 甲萘醌-4 MK4 445.2* 187.1 -21 -24 -20 445.2 227.1 -22 -22 -21 12 甲萘醌-4内标 MK4-IS 452.2 194.1 -21 -24 -20 13 甲萘醌-7 MK7 649.4* 187.1 -30 -29 -30 649.4 227.1 -32 -28 -14 14 甲萘醌-7内标 MK7-IS 656.4 194.1 -30 -29 -30 注：*为定量离子对 1.3标准溶液配制 基质匹配标准曲线制备：取7种脂溶性维生素母液，用甲醇稀释成相应浓度混标液。内标溶液使用乙腈：甲醇=9：1溶液配置成内标工作液。取 180 uL 5%BSA 溶液，20uL混标液，涡旋混匀10s， 得替代基质标准 溶液。 1.4样品前处理 ■结果讨论 2.1 MRM 色谱图 VK1(0.05 ng/mL) MK4(0.05ng/mL) MK7(0.05 ng/mL) 图1 标准曲线最低点谱图 2.2线性测定结果 对标准品按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3，7种脂溶性维生素在 标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于0.994，准确度在87.1%~110.2%之间，满足测定需求。 表3材标准曲线结果 编号 名称 线性范围 (ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 VA 20~2000 0.998 95.7~110.0 2 250HVD2 1~50 0.998 96.2~105.7 3 250HVD3 1~100 0.996 93.5~110.2 4 VE 200~20000 0.998 97.5~104.2 5 VK1 0.05~10 0.997 95.1~104.4 6 MK4 0.05~10 0.999 93.8~103.3 7 MK7 0.05~10 0.994 87.1~108.3 2.3准确度及精密度测定结果 按1.4中的前处理方法对5%BSA中添加标准溶液制作低、中、高三个浓度的质控品，每个浓度重复制备3份，按1.2中的分析条件对质控品进行分析，质控品的准确度结果如表4所示，结果显示质控品测定准确度结果与 理论值接近，回收率在 90%~105% 之间， RSD 在 1.4%~5.1%之间，满足临床测定需求。 表4质控准确度考察结果(n=3，浓度单位 ng/mL) 质控 项目 VA 250HVD2 250HVD3 VE VK1 MK4 MK7 LQC 理论浓度 40 2 2 400 0.1 0.1 0.1 测定浓度 41.1 1.88 1.89 395 0.091 0.095 0.093 回收率% 103 94 95 99 91 95 93 RSD% 5.1 3.5 4.5 1.6 4.5 5.3 5.1 MQC 理论浓度 200 5 10 2000 0.5 0.5 0.5 测定浓度 210 4.7 9.5 1951 0.46 0.47 0.45 回收率% 105 94 95 98 92 94 90 RSD% 3.4 4.2 3.1 1.4 3.7 3.1 3.2 HQC 理论浓度 1000 25 50 10000 5 5 5 测定浓度 1021 23.8 47.5 9512 4.71 4.52 4.65 回收率% 102 95 95 95 94 90 93 RSD% 2.3 2.2 3.0 1.5 2.1 2.2 2.1 2.4实际样品测定结果 取3批次血清样品，按1.4中的前处理方法及1.2中的分析条件进行测定，结果见图2和表5，该方法灵敏 度及分离度满足实际样品测定需求。 Q395.25>269.20(+) 1.20e4 VA 25OHVD2 25OHVD3 VE 图2 samplel 色谱图 表5实际样品测定结果(ng/mL) Name samplel sample2 sample3 VA 264 375 385 25OHVD2 4.6 3.8 25OHVD3 17.8 16.2 25.8 VE 14923 8276 10672 VK1 0.8 4.4 2.5 MK4 0.25 0.33 0.65 MK7 1.2 1.3 1.0 结论 使用双离子源-三重四极杆液质联用系统建立了血清中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE、VK1、MK4 及 MK7同时测定方法，使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法 线性良好，标准曲线相关系数均大于0.994，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在90%~105%之间， RSD 在1.4%~5.1%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于血清中脂溶性维生素 含量测定。 岛津应用云