GCMS法测定血浆中极长链脂肪酸含量

本文利用岛津气质联用仪GCMS-QP2020 NX建立了血浆中二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸三种极长链脂肪酸的定量方法。在10~80 µmol/L浓度范围内，二十二烷酸、二十四烷酸线性相关系数分别为0.9998和0.998，在0.4~3.2 µmol/L浓度范围内，二十六烷酸线性相关系数为0.9972，线性关系良好；取正常人血浆样本平行处理6份，连续上机分析，3种脂肪酸峰面积RSD均不超过4.5%；加标回收率实验中，依据正常人血浆中3种脂肪酸含量，C22:0、C24:0、C26:0加标浓度分别为25、25和1.0 µmol/L时，加标回收率分别为83.64%、84.69%、84.72%；加标浓度分别为75、75和3.0 µmol/L时，对应加标回收率分别为86.79%、83.50%、88.04%。实验结果表明：该方法抗干扰能力强，灵敏度高，结果准确，能够有效地监测血浆中3种极长链脂肪酸含量，检测结果为诊断X-ALD提供可靠的生化依据。Excellence in ScienceGCMS-526 GCMS 法测定血浆中极长链脂肪酸含量 GCMS-526 摘要：本文利用岛津气质联用仪 GCMS-QP2020 NX建立了血浆中二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸三种极 长链脂肪酸的定量方法。血浆样本中极长链脂肪酸经有机溶剂提取，甲酯化处理后进行分析，以二十一烷酸作为 内标，在适当浓度范围内，目标组分线性相关系数均大于 0.997，线性关系良好；取正常人血浆样本平行处理6份，连续分析，组分峰面积 RSD 均不超过 4.5%；加标回收率实验中，目标组分在两个加标浓度下的平均加标回收率 在 83%~89%之间。实验结果表明：该方法结果可靠，灵敏度高，能够有效地监测血浆中3种极长链脂肪酸含量。 关键词：：气质联用仪 血浆 极长链脂肪酸 技术特点： 心以C21：0为内标， 建立了血浆样本中 C22：0、C24：0和 C26：0的内标定量方法。 心该方法灵敏度高，重复性好，回收率稳定，能够有效检测血浆中3种极长链脂肪酸含量。 过氧化酶体在细胞代谢中起着重要作用。过氧化 物酶体组装缺陷或单一过氧化物酶体代谢紊乱与多种 遗传性疾病的发生密切相关，包括X-连锁肾上腺脑 白质营养不良症 (X-ALD)、Zellweger综合征 (ZS)、ADP-酰辅酶A氧化酶缺乏症 (AOx)和单一酰基-CoA 氧化酶缺陷症 (SCAD)。X-ALD 是过氧化酶体缺陷 病最常见的形式，由ABCD1基因突变引起，该基因 编码介导摄取极长链脂肪酸的转运蛋白，导致过氧化 酶体缺陷病患者积累极长链脂肪酸，所以血浆中极长 链脂肪酸的浓度是诊断 X-ALD 和过氧化酶体缺陷病的 重要指标。 本文利用气相色谱质谱联用仪 GCMS-QP2020NX 建立了血浆中三种极长链脂肪酸二十二烷酸 (C22：0)、二十四烷酸 (C24：0)和二十六烷酸(C26：0)的定量方法。血浆样本经有机溶剂提取，甲酯化处 理后，以二十一烷酸(C21.0)作为内标对血浆中3种 极长链脂肪酸进行定量。该方法结果准确，灵敏度高，适合于血浆中极长链脂肪酸的检测，可为诊断 X-ALD 提供生化依据。 1.1仪器 GCMS-QP2020 NX气相色谱质谱联用仪 1.2 GCMS分析 色 谱 柱注：：SH-I-5Sil MS， 30 m×0.25 mm×0.25 um 柱温程序序： 150℃ (1 min)_10℃ /min_250℃ (5 min)_10℃/min_300℃ (4 min) 进样口温度： 280℃离子化方式：EEI 载气控制模式：：恒线速度离子源温度： 230℃载 气：氦气色谱质谱接口温度： 280°℃色谱柱流量： 1.5mL/min检测器电压： 调谐电压+0.1kV 进样方式：分流进样采集 模 式： SIM，特征离子见表1 分 流 比： 20：1 样品前处理 图1 样品制备流程 ■结果与讨论 3.1极长链脂肪酸标准溶液谱图 极长链脂肪酸标准溶液按上述前处理过程进行制备，上机分析，谱图和化合物信息分别见图2和表1。 图2标准溶液谱图 (C22：0， C24：0 100 umol/L； C26：04 umol/L) 表1化合物信息 NO. 化合物名称 英文名称 简写 CAS 号 保留时间 (min) 定量离子 (m/z) 参考离子 (m/z) 1 二十一烷酸((内标) Heneicosanoic acid 一21：0 2363-71-5 12.356 340 297、255 2 二十二烷酸 Behenic acid ￥22：0 112-85-6 13.596 354 311、255 3 二十四烷酸 Lignoceric acid 一24：0 557-59-5 16.942 382 339、283 4 二十六烷酸 Hexacosanoic acid 一26：0 506-46-7 19.566 410 311 3.2标准曲线和检出限 以氯仿-甲醇(1：1，v/v)为溶剂，配置3种目标组分标准溶液， C22：0，C24：0浓度分别为 10、20、40、60、80 umol/L， C26：0浓度为0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 umol/L，上机分析。以目标物与内标物浓度比为横坐标，峰 面积比为纵坐标绘制标准曲线，见图3。根据标准曲线最低浓度点数据，以3倍信噪比 (peak to peak)计算3种目标物仪器检出限，检出限及标准曲线线性相关系数见表2，质量色谱图见图4。 图3 组分标准曲线 图4 组分质量色谱图(标准曲线最低浓度点) 表2组分标准曲线线性范围、线性相关系数及检出限 NO. 化合物名称(简写) 相关系数(R) 检出限(umol/L) 1 一22：0 0.9998 0.015 2 ￥24：0 0.9986 0.025 3 C26：0 0.9972 0.008 3.3重复性实验 按上述样本前处理流程制备 C22：0、 C24：0浓度 10 umol/L、C26：0浓度 0.4 umol/L 的混合标准溶液，连续进样 6次考察目标物峰面积重复性，3种组分峰面积结果及对应 RSD 见表3。 表3峰面积重复性结果 NO. 化合物名称(简写) 峰面积1 峰面积2 峰面积3 峰面积4 峰面积5 峰面积6 RSD% (n=6) 1 C22：0 106754 102937 107977 106625 106777 111765 2.65 2 C24：0 117637 118094 117238 113657 113393 118345 1.94 3 ￥26：0 11771 11406 11002 10847 10717 10883 3.63 GCMS-526 按上述样本前处理流程，平行制备6份血浆样品并连续进样，考察相同血浆样本中检测3种组分含量的重 复性，6份样品中C22：0、C24：0、C26：0浓度及对应 RSD 见表4。 表4 定量结果重复性 NO. 化合物名称(简写) 血浆中化合物含量量(umol/L) 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 %RSD(n=6) 1 ￥22：0 37.91 37.36 36.15 36.95 39.64 35.65 3.86 2 24：0 27.83 27.46 26.27 27.21 28.69 26.45 3.39 3 ￥26：0 0.39 0.36 0.40 0.37 0.39 0.38 4.34 3.4加标回收率 向血浆样本中添加目标组分标准溶液，高低两个加标浓度见表4，按前述样品处理流程平行处理3份，上机 分析。加标回收率详细结果见表5，加标样品谱图见图5。 图5 加标血浆样本谱谱图图 (C22：0， C24：0加标浓度25 umol/L； C26：0加标浓度1 umol/L) 表5 加标回收率结果 NO. 化合物名称 (简写) 加标浓度 (umol/L) 回收率(%) 平均回收率 (%) RSD(%) 1 2 3 1 ￥22：0 25 81.15 86.56 83.21 83.64 3.27 75 87.29 70.64 92.41 86.79 11.06 2 ￥24：0 25 80.01 89.64 84.43 84.69 5.69 75 89.67 74.04 86.79 83.50 9.96 3 ￥26：0 1.0 80.89 93.09 80.19 84.72 8.56 3.0 94.17 80.03 89.93 88.04 8.24 3.5实际样品测试结果 取血浆样本，按照上述处理过程进行样品制备后上机分析。血浆中3种组分检出结果见表6，血浆样本谱图 见图6。 图6 血浆样本谱图 表6血浆样本中目标组分检测结果 NO. 含量(umol/L) C22：0 C24：0 C26：0 血浆1 37.92 29.20 0.41 血浆2 38.47 28.93 0.42 结论 本文利用岛津气质联用仪 GCMS-QP2020 NX建立了血浆中二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸三种极长 链脂肪酸的定量方法。在10~80 umol/L 浓度范围内，二十二烷酸、 二十四烷酸线性相关系数分别为 0.9998 和 0.998，在0.4~3.2 umol/L 浓度范围内， 二十六烷酸线性相关系数为 0.9972，线性关系良好；取正常人血浆样 本平行处理6份，连续上机分析，3种脂肪酸峰面积 RSD 均不超过4.5%；加标回收率实验中，依据正常人血浆 中3种脂肪酸含量， C22：0、C24：0、C26：0加标浓度分别为25、25和1.0 umol/L时，加标回收率分别为83.64%、84.69%、84.72%；加标浓度分别为75、75和3.0 umol/L时，对应加标回收率分别为 86.79%、83.50%、88.04%。实验结果表明：该方法抗干扰能力强，灵敏度高，结果准确，能够有效地监测血浆中3种极长链脂肪 酸含量，检测结果为诊断 X-ALD 提供可靠的生化依据。 岛津应用云 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心 Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications Center