使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合蛋白沉淀前处理方法,建立了人血浆中完整胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好,标准曲线相关系数大于0.999,准确度及精密度均满足要求,可用于临床研究,辅助疾病诊断。
SSL-CA20-758Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-601 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co., LTD.- Analytical Applications CenterEmail: sshzyan@shimadzu.com.cn Tel:86(21)34193996http://www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS结合蛋白沉淀法用于人血浆中胰岛素样生长因子1的测定 LCMSMS-601 摘要:使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合蛋白沉淀前处理方法,建立了人血浆中完整胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好,标准曲线相关系数大于0.999,准确度及精密度均满足要求,可用于临床研究,辅助疾病诊断。 关键词:临床质谱血浆蛋白沉淀 IGF-1胰岛素 胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1,IGF-1)亦称为生长介素,是一种小肽类激素,结构与胰岛素原相似,其分子量为 7.6 kDa。 IGF-1的重要作用之一是介导生长激素 (GH)在外周靶器官组织的促生长作用。 前期我们已经完成了固相萃取法的方案,本文使用蛋白沉淀法,建立了人血浆中 IGF-1含量测定方法,该方法易操作,成本低,灵敏度高,,专属性强,可用于临床中相关疾病的诊断,对于 IGF-1 的临床研究亦有重要意义。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050CL联用系统。具体配置为: 输液泵: LC-30AD CL×2 在线脱气机: DGU-20A5R CL 自动进样器:SIL-30ACMP CL 柱温箱: CTO-30A CL 系统控制器: CBM-20A CL 工作站: LabSolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱: ACQUITY UPLC Peptide CSH C18 100 mm×2.1 mm l.D., 1.7 um 流动相:A相-0.1%甲酸水,B相-0.1%甲酸乙腈 柱温:55℃ 进样量: 10 uL 流速:0.4mL/min 洗脱方式:梯度洗脱,B相初始浓沐为20%,洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.50 Pumps B.Conc 30 3.50 Pumps B.Conc 50 3.51 Pumps B.Conc 95 4.00 Pumps B.Conc 95 4.01 Pumps B.Conc 20 5.00 Controller Stop 质谱条件: 分析仪器: LCMS-8050 CLDL温度:250C离子源: ESI(+)加热模块温度:400℃雾化气流速:2.0L/min接口温度:300℃干燥气流速:10.0L/min扫描模式:多反应监测(MRM)加热器流速:10.0L/minMRM参数:见表2 表2 MRM参数 名称 英文名 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 胰岛素样生长因子-1 IGF-1 1093.5* 1093.5* -44 -37 -34 1196.4 -42 -40 -38 胰岛素样生长因子-1内标 N-IGF-1 1106.9 1106.9* -42 -15 -40 1211.2 -42 -35 -40 注:66*92表示定量离子。 1.3标准样品、质控样品及内标溶液配制 用纯水溶解配制 100 ug/mLIGF-1储备液,用50%甲醇水溶液逐级稀释成浓度为156.15、312.5、625、1250、2500、5000、10000、20000 ng/mL的工作溶液。分别取标准工作溶液5 uL 加入95 uL人空白血浆中,依次配制成浓度为7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000 ng/mL的标准样品;分别取三个不同浓度工作溶液5uL加入95pL人空白血浆中,依次配制成浓度为15.625、62.5、500 ng/mL 质控样品。 用纯水溶解配制浓度为100 ug/mL 的15N-IGF-1储备液,用50%甲醇水溶液稀释为 200 ng/mL 内标溶液。 1.4人血浆样品前处理方法 a)取人血浆样品 100uL,加入内标溶液20uL,涡旋混匀; b)加入150 uL 50%三氟乙醇水溶液,涡旋混匀; c)加入200 uL 20%乙腈丙酮溶液(含5%乙酸),涡旋混匀; d)4000 g离心10 min; e)吸取200uL 上清液加入1600 uL冰乙醇,混匀置于-20℃放置 45 min; f)4000 g 离心30 min; g)将上清液倒出,用1600 uL冰乙醇清洗沉淀; h)取 100 uL 10%乙水溶液(含1%甲酸)溶解沉淀,上机分析。 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 图1 标准样品 (7.8125ng/mL) 及空白样品谱图 标准样品及空白样品谱图如图1所示,从图中可以看到空白空品对 IGF-1及内标的检测均无干扰,方法专属性良好。 2.2线性测定结果 标准样品经过1.4中的前处理后按1.2中的分析条件进行分析,内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3,线性相关系数大于0.999,准确度在88.5%~109.6%之间,满足测定需求。 表3 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性生围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) IGF-1 Y=(0.006088576)X+(0.01493820) 7.8125~1000 0.999 88.5~109.6 图2 标准曲线 2.3准确度及精密度测定结果 按1.4中的前处理方法对低中高三浓度质控样品进行前处理,按1.2中的分析条件对质控样品进行分析,每个样品平行制备6份,质控品的准确度及精密度结果如表4所示,结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近,均在理论值的±20%范围内,满足临床测定需求。样品平行制备6份进样分析,测定结果RSD在2.1%~6.7%之间,满足临床测定需求。 表6质控样品准确度及精密度考察结果(n=6) 样品类型 理论浓度 (ng/mL) 准确度% 精密度 RSD% LQC 15.625 91.2 5.6 MQC 62.5 93.4 1.1 HQC 500 98.5 2.4 结论 使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合蛋白沉淀法,建立了人血浆中胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好,准确度及精密度均满足临床要求,易操作,成本低。该方法可供临床研究参考。 岛津应用云 使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合蛋白沉淀法,建立了人血浆中胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好,准确度及精密度均满足临床要求,易操作,成本低。该方法可供临床研究参考。
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岛津企业管理(中国)有限公司为您提供《人血浆中胰岛素样生长因子1检测方案(液质联用仪)》,该方案主要用于全血/血清/血浆中生化检验检测,参考标准--,《人血浆中胰岛素样生长因子1检测方案(液质联用仪)》用到的仪器有岛津三重四极杆液质谱联用仪LCMS-8050