人血浆中胰岛素样生长因子1检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-758Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-601 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS结合蛋白沉淀法用于人血浆中胰岛素样生长因子1的测定 LCMSMS-601 摘要：使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合蛋白沉淀前处理方法，建立了人血浆中完整胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数大于0.999，准确度及精密度均满足要求，可用于临床研究，辅助疾病诊断。 关键词：临床质谱血浆蛋白沉淀 IGF-1胰岛素 胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1，IGF-1)亦称为生长介素，是一种小肽类激素，结构与胰岛素原相似，其分子量为 7.6 kDa。 IGF-1的重要作用之一是介导生长激素 (GH)在外周靶器官组织的促生长作用。 前期我们已经完成了固相萃取法的方案，本文使用蛋白沉淀法，建立了人血浆中 IGF-1含量测定方法，该方法易操作，成本低，灵敏度高，，专属性强，可用于临床中相关疾病的诊断，对于 IGF-1 的临床研究亦有重要意义。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050CL联用系统。具体配置为： 输液泵： LC-30AD CL×2 在线脱气机： DGU-20A5R CL 自动进样器：SIL-30ACMP CL 柱温箱： CTO-30A CL 系统控制器： CBM-20A CL 工作站： LabSolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： ACQUITY UPLC Peptide CSH C18 100 mm×2.1 mm l.D.， 1.7 um 流动相：A相-0.1%甲酸水，B相-0.1%甲酸乙腈 柱温：55℃ 进样量： 10 uL 流速：0.4mL/min 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓沐为20%，洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.50 Pumps B.Conc 30 3.50 Pumps B.Conc 50 3.51 Pumps B.Conc 95 4.00 Pumps B.Conc 95 4.01 Pumps B.Conc 20 5.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8050 CLDL温度：250C离子源： ESI(+)加热模块温度：400℃雾化气流速：2.0L/min接口温度：300℃干燥气流速：10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)加热器流速：10.0L/minMRM参数：见表2 表2 MRM参数 名称 英文名 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 胰岛素样生长因子-1 IGF-1 1093.5* 1093.5* -44 -37 -34 1196.4 -42 -40 -38 胰岛素样生长因子-1内标 N-IGF-1 1106.9 1106.9* -42 -15 -40 1211.2 -42 -35 -40 注：66*92表示定量离子。 1.3标准样品、质控样品及内标溶液配制 用纯水溶解配制 100 ug/mLIGF-1储备液，用50%甲醇水溶液逐级稀释成浓度为156.15、312.5、625、1250、2500、5000、10000、20000 ng/mL的工作溶液。分别取标准工作溶液5 uL 加入95 uL人空白血浆中，依次配制成浓度为7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000 ng/mL的标准样品；分别取三个不同浓度工作溶液5uL加入95pL人空白血浆中，依次配制成浓度为15.625、62.5、500 ng/mL 质控样品。 用纯水溶解配制浓度为100 ug/mL 的15N-IGF-1储备液，用50%甲醇水溶液稀释为 200 ng/mL 内标溶液。 1.4人血浆样品前处理方法 a)取人血浆样品 100uL，加入内标溶液20uL，涡旋混匀； b)加入150 uL 50%三氟乙醇水溶液，涡旋混匀； c)加入200 uL 20%乙腈丙酮溶液(含5%乙酸)，涡旋混匀； d)4000 g离心10 min； e)吸取200uL 上清液加入1600 uL冰乙醇，混匀置于-20℃放置 45 min； f)4000 g 离心30 min； g)将上清液倒出，用1600 uL冰乙醇清洗沉淀； h)取 100 uL 10%乙水溶液(含1%甲酸)溶解沉淀，上机分析。 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 图1 标准样品 (7.8125ng/mL) 及空白样品谱图 标准样品及空白样品谱图如图1所示，从图中可以看到空白空品对 IGF-1及内标的检测均无干扰，方法专属性良好。 2.2线性测定结果 标准样品经过1.4中的前处理后按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3，线性相关系数大于0.999，准确度在88.5%~109.6%之间，满足测定需求。 表3 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性生围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) IGF-1 Y=(0.006088576)X+(0.01493820) 7.8125~1000 0.999 88.5~109.6 图2 标准曲线 2.3准确度及精密度测定结果 按1.4中的前处理方法对低中高三浓度质控样品进行前处理，按1.2中的分析条件对质控样品进行分析，每个样品平行制备6份，质控品的准确度及精密度结果如表4所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，均在理论值的±20%范围内，满足临床测定需求。样品平行制备6份进样分析，测定结果RSD在2.1%~6.7%之间，满足临床测定需求。 表6质控样品准确度及精密度考察结果(n=6) 样品类型 理论浓度 (ng/mL) 准确度% 精密度 RSD% LQC 15.625 91.2 5.6 MQC 62.5 93.4 1.1 HQC 500 98.5 2.4 结论 使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合蛋白沉淀法，建立了人血浆中胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，准确度及精密度均满足临床要求，易操作，成本低。该方法可供临床研究参考。 岛津应用云 使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合蛋白沉淀法，建立了人血浆中胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，准确度及精密度均满足临床要求，易操作，成本低。该方法可供临床研究参考。