广西钦州牡蛎（生蚝）酶解产物EPO中蛋白质含量的检测

广西钦州牡蛎酶解产物促进小鼠皮肤创伤愈合效果研究大连海洋大学学报ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＡＬＩＡＮ ＯＣＥＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ第 ３４卷第 ５期２ ０ １ ９年 １ ０月Ｖｏｌ.３４ Ｎｏ.５Ｏｃｔ . ２ ０ １ ９文章编号:２０９５－１３８８(２０１９)０５－０６４９－０７ 大连海洋大学学报第３４卷０５６ ＤＯＩ :１０.１６５３５ / ｊ.ｃｎｋｉ.ｄｌｈｙｘｂ.２０１９－１０９ 牡蛎酶解产物促进小鼠皮肤创伤愈合效果研究 杨发明 １ꎬ 林海生 １、２ꎬ 秦小明 １、２∗ꎬ 章超桦 １、２ꎬ 曹文红 １、２ꎬ 高加龙 １、２ (１??广东海洋大学食品科技学院 ꎬ 广东湛江 ５２４０８８ꎻ ２??广东省水产品加工与安全重点实验室 ꎬ 广东普通高等学校水产品深加工 重点实验室 ꎬ 国家贝类加工技术研发分中心 (湛江 )ꎬ 南海生物资源开发与利用协同创新中心 ꎬ 广东湛江 ５２４０８８) 摘要 :为探讨香港牡蛎 Ｃｒｏｓｓｏｓｔｒｅａ ｓｉｋａｍｅａ 酶解产物 (ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｏｙｓｔｅｒꎬ ＥＰＯ)对小鼠皮肤软组 织开放性创伤的愈合效果 ꎬ 构建直径约 ０??８ ｃｍ 的小鼠 (体质量为 ２０ ｇ±２ ｇ)背部全皮层创伤模型 ꎬ 试验设 每天涂抹 ３０~３５ ｍｇ ＥＰＯ (肽含量为 １??５~２??５ ｍｇ)的给药组和每天涂抹 ２~３ ｍｇ 云南白药的阳性对照组 ꎬ 以及不做任何处理的阴性对照组 ꎬ 采用体外抗菌 、体表促凝血和小鼠皮肤愈合试验 ꎬ 进行了 ＥＰＯ 对小鼠皮 肤创伤愈合作用效果及作用阶段的研究 ꎮ 结果表明 : ＥＰＯ 无促凝血作用 ꎬ 且对 １３种常见革兰氏阴性和阳 性菌株无抑制作用 ꎻ 各试验组动物在第 ２天时皆已结疤 ꎬ 第 ６、 １０、 １４天时给药组创伤愈合率均显著高于 阴性对照组 (Ｐ <０??０５)ꎻ ＥＰＯ 可显著提高瘢痕收缩率 (Ｐ <０??０５)ꎻ 生化指标测试结果显示 ꎬ ＥＰＯ 对炎症因 子白介素 －６ (ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ꎬ ＩＬ－６)生成无显著性影响 (Ｐ >０??０５)ꎬ 但第 ３天时可显著促进白介素 －１０ (ｉｎ￣ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ꎬ ＩＬ－１０)分泌 (Ｐ <０??０５)ꎻ 给药组碱性成纤维细胞生长因子 (ＦＧＦ－２)含量显著低于两个对照 组 (Ｐ <０??０５)ꎬ 转化生长因子 β (ＴＧＦ－β)含量显著高于阴性对照组 (Ｐ <０??０５)ꎬ 细胞生长周期素 １ (ＣＣ￣ＮＤ１)含量显著高于两个对照组 (Ｐ <０??０５)ꎻ 给药后第 ７天 ꎬ 给药组羟脯氨酸含量较阴性对照组降低 ꎬ 第 １４天时较阴性对照组升高 ꎬ 但均无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎮ 研究表明 ꎬ 涂抹 ＥＰＯ 可以加快小鼠软组织开放 性创伤愈合 ꎬ 对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用 ꎮ 关键词 :香港牡蛎 ꎻ 酶解产物 ꎻ 涂抹 ꎻ 皮肤 ꎻ 瘢痕增生 中图分类号 : ＴＳ２１８ꎻ ＴＳ２０９ꎻ Ｒ６４１ 文献标志码 : Ａ 香港牡蛎 Ｃｒｏｓｓｏｓｔｒｅａ ｓｉｋａｍｅａ 广泛分布于中国 广东 、广西海域 ꎬ 其肉质鲜美 、营养丰富全面 ꎬ 素 有 “海洋牛奶 ”之美名 [１]ꎮ 牡蛎是第一批入选食 药同源的食物 ꎬ 其具有抗氧化 [２]、免疫 [３]、抗疲 劳 [４]、抗肿瘤 [５]、抑菌 [６]、改善记忆 [７]、解酒护 肝 [８]等功能活性 ꎬ 这为进行创伤愈合研究奠定了 理论基础 ꎬ 但尚未有对其进行深入的营养保健或药 用价值相关报道 ꎬ 因此 ꎬ 有必要对牡蛎的功能价值 进行充分开发利用 ꎮ 皮肤是人体最大的器官 ꎬ 结构复杂 ꎬ 可以保护 身体免受外部环境 、病原体和物理的侵害 [９]ꎮ 由 于皮肤总是暴露在外部环境中 ꎬ 故受伤概率较大 ꎮ 伤口通常是由正常组织的结构和功能被破坏引起 ꎬ 导致皮肤破裂造成身体伤害 ꎮ 创伤愈合是一个动态 的交互过程 ꎬ 包含止血 /炎症 、增殖和组织重塑 ３个重叠阶段 ꎬ 这些阶段的任何异常都将导致慢性伤 口或严重的组织纤维化 [１０]ꎮ 而治疗慢性伤口可能 较为持久 ꎬ 不仅需要特定的医疗技能 ꎬ 对当代医学 已构成巨大挑战 ꎬ 同时 ꎬ 全世界约有两千万人受慢 性伤口的困扰 ꎮ 由于人口老龄化 ꎬ 以及肥胖和糖尿 病等人群不断上升 ꎬ 这一数字可能会显著增加 [１１]ꎮ 因此 ꎬ 加速创伤愈合对身体健康至关重要 ꎮ 传统的 创伤愈合活性物质 ꎬ 包括生长因子 、细胞因子 、从 植物中获得的化合物 ꎬ 以及其他免疫调节因子 ꎬ 都 难以将其转化成临床促愈疗法 [１２]ꎮ 近年来 ꎬ 与高 成本且存在安全性和递送问题的药物相比 ꎬ 具有高 活性 、特异性和稳定性的生物活性肽在相关研究领 域引起了研究人员的兴趣 [１３]ꎮ 随着国内外对海洋 来源活性肽功能作用的深入研究 ꎬ 已发现部分活性 肽在皮肤组织创伤愈合方面具有较高的潜在应用价 值 ꎬ 如海洋胶原蛋白肽 [１４ꎬ５]、鱼皮胶原蛋白肽 [１５]等 ꎮ 收稿日期 : ２０１９－０５－０８ 基金项目 :国家现代农业产业技术体系专项 (ＣＡＲＳ－４９)ꎻ 广东海洋大学博士启动项目 (Ｒ１７０８２)ꎻ 广东普通高等学校水产品高值化加工 与利用创新团队项目 (ＧＤＯＵ２０１６０３０５０３)ꎻ 广东省应用型科技研发专项资金项目 (２０１６Ｂ０２０２３５００２) 作者简介 :杨发明 (１９９５—)ꎬ 男 ꎬ 硕士研究生 ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ:ｙａｎｇｆｍ０１２３＠ １６３??ｃｏｍ 通信作者 :秦小明 (１９６４—)ꎬ 男 ꎬ 教授 ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ:ｘｉａｏｍｉｎｇ０５０２＠ ２１ｃｎ??ｃｏｍ 本研究中 ꎬ 采用可控酶法制备牡蛎酶解产物 (ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆｏｙｓｔｅｒꎬ ＥＰＯ)ꎬ 开展 ＥＰＯ 促进小鼠皮肤软组织创伤愈合作用探讨 ꎬ 旨在为进 一步深入研究其机制提供理论参考 ꎮ １ 材料与方法 １??１ 材料 试验用牡蛎肉购自广西钦州 ꎮ 试验用 ＳＰＦ 级 昆明小鼠体质量为 (２０±２) ｇꎬ 雄性 ꎬ 购自山东省 济南朋悦实验动物繁育有限公司 ꎬ 实验单位使用许 可证编号 ＳＹＸＫ (粤 ) ２０１４－００５３ꎮ 云南白药购自 云南白药集团 ꎮ 抗菌试验所需菌株由广东省水产品 加工与安全重点实验室提供 ꎮ 试验试剂 :动物蛋白酶 (３万 Ｕ/ ｇ)购自广西 南宁庞博生物工程有限公司 ꎻ 白介素 －６ (ｉｎｔｅｒｌｅｕ￣ｋｉｎ ６ꎬ ＩＬ－６)、白介素 －１０ (ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ꎬ ＩＬ－１０)、生长因子转化生长因子 β ( ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－βꎬ ＴＧＦ－β)、碱性成纤维细胞生长因 子 (ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２ꎬ ＦＧＦ－２)、表皮细胞 生长因子 (ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒꎬ ＥＧＦ)、细胞生 长周期素 １ (Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ꎬ ＣＣＮＤ１)和羟脯氨酸测定 试剂盒购自南京建成生物工程研究所 ꎮ 试验仪器 : Ｌｙｎｘ ６０００型高速冷冻离心机 、多 功能酶标仪购自 Ｔｈｅｒｍｏ 公司 ꎻ ＢＳＡ２２４Ｓ－ＣＷ 型万 分之一电子天平购自赛多利斯科学仪器 (北京 )有限公司 ꎻ ＦＥ２８型 ｐＨ 计购自梅特勒 —托利多仪 器 (上海 )有限公司 ꎻ ＤＦ－１０１Ｔ 集热氏恒温加热 磁力搅拌器购自上海精宏实验设备有限公司 ꎻ ＦＤＵ－１１１０型冷冻干燥机购自上海爱朗仪器有限公 司 ꎻ ＳＷ－ＣＪ－２ＦＤ 型双人超级操作台 ꎬ 苏州净化设 备有限公司 ꎮ １??２ 方法 １??２??１ ＥＰＯ 制备工艺 将牡蛎肉清洗 、打浆 ꎬ ｐＨ 值调至 ７??０ꎬ 加入 １０００ Ｕ/ ｇ (蛋白 )的动物蛋白 酶 ꎬ 酶解 ５ ｈꎬ 灭酶 １０ ｍｉｎꎬ 以 ８０００ ｒ/ｍｉｎ 离心 ꎬ 浓缩 ꎬ 冷冻干燥 [１６]ꎮ 采用凯氏定氮法 [１７]、甲醛滴 定法 [１７]和双缩脲法分别测定蛋白质含量 、水解度 和肽含量 ꎮ １??２??２ ＥＰＯ 体外抗菌试验 采用微量径向扩散法 和半数稀释法 [１８]测定 ＥＰＯ 对 ６中革兰氏阳性菌和 ７种革兰氏阴性菌的抗菌活性 ꎮ １??２??３ ＥＰＯ 体表促凝血试验 用断尾法 [１９]测定 ＥＰＯ 对小鼠体表创口出血时间和出血量的影响 ꎮ １??２??４ ＥＰＯ 急性皮肤毒性试验 选取 ＳＰＦ 级昆明 小鼠 １０只 ꎬ 随机分成空白对照组和 ＥＰＯ 涂抹组 ꎮ 试验方法参考文献 [２０]ꎮ １??２??５ 动物分组及创伤模型建立 选取 ＳＰＦ 清洁 级昆明雄性小鼠 ６０只 ꎬ 随机分为 ３组 ꎬ 每组 ２０只 ꎬ 分别为阴性对照组 、云南白药阳性对照组和 ＥＰＯ 给药组 ꎮ 将小鼠用 １０％水合氯醛腹腔麻醉后 ꎬ 背部剃毛 、消毒 ꎮ 在小鼠背部剪去直径约 ０??８ ｃｍ 的全层皮肤 ꎬ 造成全皮层创伤动物模型 ꎮ 每只小鼠 均分笼饲养 ꎬ 给药组每天涂抹 ３０~３５ ｍｇ ＥＰＯ (肽 含量为 １??５~２??５ ｍｇ)ꎬ 阳性对照组每天涂抹 ２~３ｍｇ 云南白药 ꎬ 阴性对照组不做任何处理 ꎮ 每 ２天 对小鼠创伤口面观察 、拍照 、测量伤口大小 ꎬ 并记 录结果 ꎮ １??２??６ 愈合率及瘢痕缩小率 每隔 ２ ｄ 用游标卡 尺测量创面直径大小一次 ꎬ 计算创伤愈合率 : 瘢痕缩小率 ＝ (第 ０天创面直径 －第 １４天瘢痕 长度 ) /第 ０天创面直径 ×１００％ꎮ １??２??７ 瘢痕组织中生化指标测定 小鼠创面组织 匀浆液制备参考文献 [２１]ꎬ 分装于 －８０ ℃下保藏 待测 ꎮ ＩＬ－６、 ＩＬ－１０、 ＴＧＦ－β、 ＦＧＦ－２、 ＥＧＦ、 ＣＣ￣ＮＤ１和羟脯氨酸含量的检测均按照试剂盒说明书 进行 ꎮ １??３ 数据处理 试验数据采用平均值 ±标准差表示 (ｍｅａｎ±Ｓ??Ｄ??)ꎬ 每组试验至少重复 ３次 ꎬ 采用 ＳＰＳＳ ２０软 件进行统计学分析 ꎮ 组间比较采用 ＬＳＤ 检验 ꎬ 显 著性水平设为 ０??０５ꎮ ２ 结果与分析 ２??１ 牡蛎酶解产物 (ＥＰＯ )的基本性质 本试验中自制的 ＥＰＯ 主要质量指标为加酶量 为 １０００ Ｕ/ ｇꎬ 蛋白的牡蛎酶解液水解度为 ２６??３３％ꎬ ＥＰＯ 的蛋白质含量为 ４３??５４ ｇ /１００ ｇꎬ 肽 含量为 ２５??２６％ꎮ ２??２ 体外抗菌试验结果 采用微量径向扩散法和半数稀释法测定 ＥＰＯ 对常见的 １３种菌株的抑制作用 ꎬ 其中 ６种革兰氏 阳性菌株分别为金黄色葡萄球菌 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕ￣ｒｅｕｓ 、芽孢杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ 、李斯特菌 Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙ￣ ｔｏｇｅｎｅｓ 、海豚链球菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ 、格氏乳球 菌 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａ 和无乳链球菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ꎬ ７种革兰氏阴性菌分别为大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 、铜绿假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉ￣ｎｏｓａ 、溶藻弧菌 Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ 、副溶血性弧菌 Ｖ ??Ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ 、海藻希瓦氏菌 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ａｌｇａｅ 、哈氏弧菌 Ｖ ??ｈａｒｖｅｙｉ 和嗜水气单胞菌 Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙ￣ｄｒｏｐｈｉｌａ ꎮ 体外抗菌试验结果显示 ꎬ ＥＰＯ 无抗菌活 性 ꎮ ２??３ 体表促凝血试验结果 ＥＰＯ 对小鼠体表创口出血时间和出血量的影 响如表 １所示 ꎬ 与阴性对照组相比 ꎬ ＥＰＯ 可缩短 出血时间和减少出血量 ꎬ 但无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎬ 而云南白药阳性对照组则极显著好于其他 组 (Ｐ <０??０１)ꎮ 这表明 ꎬ ＥＰＯ 不具有促凝血作用 ꎮ 表 １ ＥＰＯ 对小鼠断尾创口出血时间和出血量的影响 (ｎ ＝５) Ｔａｂ??１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｔａｉｌ ｗｏｕｎｄ (ｎ ＝５) 组别 ｇｒｏｕｐ 出血时间 /ｍｉｎ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ 出血量 / ｇ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｂｌｅｅｄｉｎｇ 阴性对照组 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ５??０５±０??７９ ０??０１５２±０??００１９ 阳性对照组 ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ０??９４±０??４９∗∗ ０??００５４±０??００１７∗∗ 给药组 ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ４??３３±０??７９ ０??０１４４±０??００１１ 注 : ∗∗表示与阴性对照组有极显著性差异 (Ｐ <０??０１) Ｎｏｔｅ: ∗∗ｍｅａｎｓ ｖｅｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (Ｐ <０??０１) ２??４ ＥＰＯ 急性皮肤毒性试验结果 连续涂抹 ＥＰＯ ３ ｄ 后 ꎬ 所有小鼠均未出现红斑 和水肿现象 ꎮ 停药后继续观察 ２ ｄꎬ 也未出现红斑 和水肿 ꎬ 且均未出现动物体质量下降 、站立不稳 、精神萎靡等其他异常变化 ꎮ 这表明 ꎬ ＥＰＯ 对小鼠 无毒性 ꎮ ２??５ ＥＰＯ 对小鼠皮肤伤口愈合作用的影响 ２??５??１ 创面形态变化观察 各组愈合情况如图 １所示 ꎬ 造模后第 ２天 ꎬ 各试验组动物皆已结痂 ꎬ 伤 口周围出现红肿 ꎬ 无液体渗出 ꎬ 伤口收缩均不明 显 ꎮ 第 ２、 ４天时 ꎬ 各组创面结痂局部不断变硬 ꎬ 创伤周围表面不平整 ꎬ 创缘皮肤收缩较明显 ꎮ 第 ６、 ８、 １０天时 ꎬ 阴性对照组伤口结痂不断变厚 ꎬ 呈黑红色 ꎬ 但瘢痕面积变化小 ꎻ 阳性对照组伤口缩 小 ꎬ 并开始部分脱痂 、缩痂明显 ꎻ ＥＰＯ 给药组在 第 ６天时已掉痂 ꎬ 缩痂明显优于两对照组 ꎮ 第 １２天时 ꎬ 各组皆已掉痂 ꎬ 愈合处开始长出毛发 ꎬ 其中 给药组进一步缩痂 ꎮ 第 １４天时 ꎬ 阴性对照组的多 数伤口直径小于 ２ ｍｍꎬ 各给药组伤口直径均小于 １ ｍｍꎬ 呈现肉红色新生皮肤 ꎬ 新生肉色组织完整 ꎮ 给药组较阴性对照组愈合情况良好 ꎬ 无增生性瘢痕 及瘢痕疙瘩生成 ꎮ ２??５??２ 愈合率 从表 ２可见 :造模后第 ６天时 ꎬ ＥＰＯ 给药组的伤口愈合率均在 ３５％以上 ꎬ 与阴性 对照组相比 ꎬ 高出 ２１％ (Ｐ <０??０５)ꎻ 造模后第 １０天时 ꎬ 给药组显著高于阴性对照组 (Ｐ <０??０５)ꎬ 高 出 ４０％ꎻ 第 １４天时 ꎬ 给药组愈合率达 ９４??１７％ꎬ 较 图 １ ＥＰＯ 对小鼠创面的影响 Ｆｉｇ??１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｗｏｕｎｄ ｏｆ ｍｉｃｅ 阴性对照组高出 １４％ (Ｐ <０??０５)ꎮ 由图 ２可知 ꎬ 给药组瘢痕缩小率显著高于阴性 对照组 (Ｐ <０??０５)ꎮ 给药组和阳性对照组在创伤愈 合时期 ꎬ 创伤愈合速率均显著高于阴性对照组 (Ｐ <０??０５)ꎬ 但给药组与阳性对照组相比无显著性 差异 (Ｐ >０??０５)ꎮ 创伤愈合后期 (１４ ｄ)ꎬ 各试验 组创伤愈合速率逐渐趋于平衡 ꎬ 给药组效果突出 (表 ２云 )ꎮ 南白药 (粉 )是中国最著名的专利药之一 ꎬ 主要由中草药三七 [２２]开发 ꎬ 传统上用于止血和改 善创伤性损伤的循环 [２３]ꎮ 其中三七皂苷表现出抗 炎 、抗糖尿病 、抗氧化和抗肿瘤特性 ꎬ 所以云南白 药 (粉 )可能是通过加快止血 ꎬ 促进血液循环和 消炎作用以实现促进创伤愈合 ꎮ 虽然阳性对照组与 给药组创伤愈合速率无显著性差异 ꎬ 但 ＥＰＯ 给药 组效果更好 ꎬ 瘢痕较小 ꎬ 几乎达到无痕状态 ꎮ 成分 检测结果显示 ꎬ ＥＰＯ 主要成分是蛋白质 ꎬ 而其中 肽含量较高 ꎬ 且具有膜透过性好 、激活细胞活性 、修复人体变性细胞等生物活性 [１８]ꎬ 推测 ＥＰＯ 具有 相关功能活性肽并起主要作用 ꎮ 表 ２ ＥＰＯ 对小鼠皮肤创伤愈合的影响 (愈合率 ) Ｔａｂ??２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ (ｈｅａｌｉｎｇ ｒａｔｅ ) ｉｎ ｍｉｃｅ ％ 组别 ｇｒｏｕｐ ０ ｄ ６ ｄ １０ ｄ １４ ｄ 阴性对照 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ０ １４??１７±２??８９ｂ ３５??８６±８??６６ｂ ８０??４２±６??１７ｂ 阳性对照 ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ０ ３５??８３±６??８８ａ ５６??６７±１７??０２ａ ９２??９２±６??４１ａ 给药组 ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ０ ３５??８３±１２??２７ａ ７５??００±４??３３ａ ９４??１７±１０??１０ａ 注 :同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异 (Ｐ <０??０５)ꎬ 标有相同字母者表示组间无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎬ 下同 Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ０??０５ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｌｅｖｅｌꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓꎬ ｅｔ ｓｅｑｕｅｎｔｉａ 组别 group 注 :标有不同字母者表示组间有显著性差异 (Ｐ <０??０５)ꎬ 标有 相同字母者表示组间无显著性差异 (Ｐ >０??０５) Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ０??０５ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｌｅｖｅｌꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ 图 ２ ＥＰＯ 对小鼠皮肤创伤瘢痕生成的影响 Ｆｉｇ??２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｓｃａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ２??５??３ 炎症因子测定 根据环境刺激 ꎬ 巨噬细胞 具有广泛的功能 ꎬ 特别是通过释放多种因素来调节 先天免疫反应 ꎮ 目前 ꎬ 巨噬细胞已被初步分为分泌 ＩＬ－６等促炎症因子的 Ｍ１型和分泌 ＩＬ－１０等抗炎症 因子的 Ｍ２型 [２４]两个主要表型 ꎮ 于是 ꎬ 本研究中 选择造模后第 ３、 ５、 ７天时的 ＩＬ－６与 ＩＬ－１０含量 进行测定 ꎬ 结果如图 ３和图 ４所示 ꎮ 从图 ３可见 :第 ３、 ７天时 ꎬ 给药组 ＩＬ－６含量 与两个对照组均无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎻ 第 ５天 时 ꎬ 阳性对照组与阴性对照组有显著性差异 (Ｐ <０??０５)ꎮ 这表明 ꎬ ＥＰＯ 对小鼠创伤皮肤组织中炎症 因子 ＩＬ－６含量生成无影响 ꎮ 时间t i me /d 注 :同一时间下 ꎬ 标有不同字母者表示组间有显著性差异 (Ｐ <０??０５)ꎬ 标有相同字母者表示组间无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎬ 下同 Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ａｒｅ ｓｉｇ￣ｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ０??０５ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｌｅｖｅｌꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓꎬ ｅｔ ｓｅｑｕｅｎｔｉａ 图 ３ ＥＰＯ 对创伤皮肤组织中炎症因子 ＩＬ－６含量的影 响 Ｆｉｇ??３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ＩＬ－６ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ 从图 ４可见 :第 ３天时 ꎬ 给药组和阳性对照组 ＩＬ－１０含量均显著高于阴性对照组 (Ｐ <０??０５)ꎻ 第 ５天时 ꎬ 阳性对照组 ＩＬ－１０含量显著高于其他组 (Ｐ <０??０５)ꎻ 第 ７天时 ꎬ 阳性对照组和给药组 ＩＬ－１０含量均显著低于阴性对照组 (Ｐ <０??０５)ꎮ Ｄｕ 等 [２５]报道 ꎬ Ｍ１巨噬细胞的浸润在损伤后 第 １天时炎症因子显著增加 ꎬ 在第 ３天时达到峰 值 ꎬ 随后降低 ꎻ Ｍ２巨噬细胞的数量在第 ３天时也 迅速增加 ꎬ 在第 ５天时达到最大值 ꎬ 在第 ７天和第 ９天时逐渐减少 ꎬ 而 Ｍ２巨细胞在损伤后第 ５天时 图 ４ ＥＰＯ 对创伤皮肤组织中抗炎症因子 ＩＬ－１０含量 的影响 Ｆｉｇ??４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ＩＬ－１０ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ 取代 Ｍ１巨噬细胞作为伤口中的主要巨噬细胞 ꎮ 本 研究结果与此研究结果一致 ꎮ ２??５??４ 生长因子 ＦＧＦ－２具有有效的促血管生成 功能 ꎬ 并参与各种细胞功能 ꎬ 包括应激后的分化 、迁移 、增殖等作用 [２６－２７]ꎮ ＴＧＦ－β 是一种主要的细 胞因子 ꎬ 参与瘢痕组织中发生的过度胶原合成 ꎬ 还 可通过增强细胞迁移和信号传导起到帮助伤口愈合 的良性作用 [２８－２９]ꎮ ＣＣＮＤ１主要功能是促进细胞增 殖 [３０－３１]ꎮ ＥＧＦ 促进创面愈合最主要的作用是促进 创面组织的增殖和分化 ꎬ 增殖和分化形成的新细胞 代替衰老和已经死亡的细胞 [３２]ꎮ 从表 ３可见 ꎬ 给药组 ＦＧＦ－２含量显著低于两 个对照组 (Ｐ <０??０５)ꎬ ＴＧＦ－β 含量显著高于阴性 对照组 (Ｐ <０??０５)ꎬ ＣＣＮＤ１含量显著高于两个对 照组 (Ｐ <０??０５)ꎬ 而 ＥＧＦ 含量高于阴性对照组 ꎬ 但无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎮ 由此可以推测 ꎬ ＥＰＯ 促进创面愈合的过程中通过加速细胞因子 ＴＧＦ－β 的分泌促进成纤维细胞分泌胶原 、增加胞外基质沉 积 、促进新血管形成及表皮细胞生长 ꎮ 同时 ꎬ 也通 过加速细胞周期调控蛋白 ＣＣＮＤ１的表达促进成纤 维细胞等细胞周期向分裂期转化 ꎬ 从而加速细胞的 有丝分裂以实现同愈合率结果一致的创伤愈合 ꎮ 这 表明 ꎬ 涂抹 ＥＰＯ 在增殖期可通过促进 ＴＧＦ－β 和 ＣＣＮＤ１的分泌 ꎬ 从而加快小鼠皮肤创伤愈合 ꎮ 表 ３ ＥＰＯ 对创伤皮肤组织中生长因子的影响 Ｔａｂ??３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｎｇ /ｍＬ 组别 成纤维细胞生长因子 ２ ＦＧＦ－２ 转化生长因子β ＴＧＦ－β 细胞生长周期素 ＣＣＮＤ１ 表皮生长因子 ＥＧＦ ｇｒｏｕｐ 阴性对照组 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ３６??５８±２??６５ａ ０??４４±０??０４ａ １??６７±０??５０ａ １３１??３７±５９??５１ａ 阳性对照组 ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ２８??７２±５??６５ａ １??５５±０??１１ｂ ２??７４±１??２１ａ １６７４??３４±９１３??７８ｂ 给药组 ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ２６??５１±４??７７ｂ １??５７±０??０８ｂ ８??０３±０??２０ｂ ３４０??８８±１４４??９７ａ ２??５??５ 羟脯氨酸含量 创伤愈合的最后阶段是重 塑阶段 ꎬ 成纤维细胞分化成收缩的肌成纤维细胞 ꎬ 其收缩伤口并且在增殖期期间沉积的胶原蛋白 Ⅲ被 交换为具有更高拉伸强度的胶原蛋白 Ⅰꎬ 加快创面 组织中胶原蛋白与其他蛋白质分子形成紧密的交 联 [３３]ꎬ 可通过测定羟脯氨酸含量来反映胶原蛋白 含量的变化情况 ꎮ 从表 ４可见 :造模后第 ７天时 ꎬ 给药组羟脯氨 酸含量低于阴性对照组但无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎬ 略高于阳性对照组 (Ｐ >０??０５)ꎻ 造模后第 １４天时 ꎬ 给药组羟脯氨酸含量高于阴性对照组 ꎬ 但给药组与两个对照组间均无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎮ 这表明 ꎬ ＥＰＯ 具有一定促进胶原蛋白的分 泌 、沉积和交联的作用 ꎮ 这与创面愈合照片 、愈合 率 、瘢痕缩小率和 ＦＧＦ－２含量结果一致 ꎬ 但羟脯 氨酸含量测定结果并不理想 ꎬ 在后续试验中可通过 调整测定指标进行进一步的验证和阐释 ꎮ ３ 结论 本研究中针对皮肤创伤愈合全阶段试验指标的 表 ４ ＥＰＯ 对创伤皮肤组织中羟脯氨酸含量的影响 Ｔａｂ??４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ μｇ/ｍＬ 组别 ｇｒｏｕｐ ７ ｄ １４ ｄ 阴性对照组 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ７??５８±０??００ａｂ １３??１０±２??１１ｂ 阳性对照组 ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ４??６０±０??９９ａ ２３??８６±２??７３ａ 给药组 ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ５??４６±１??９４ｂｃ １９??０６±０??５４ａ ｂ 选择 ꎬ 进行体外试验及涂抹给药的动物试验 ꎬ 结果 表明 ꎬ 在皮肤创伤愈合过程中 ꎬ 涂抹牡蛎酶解产物 通过抑制炎症作用 ꎬ 促进生长因子分泌及胶原蛋白 的沉积与交联 ꎬ 从而加快了小鼠软组织开放性创伤 愈合 ꎬ 且对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用 ꎮ 本 研究发现并开拓了皮肤创伤愈合活性物质的来源 ꎬ 但其具体作用功能因子尚不确定且机理不明 ꎬ 后续 试验将对牡蛎酶解产物进行分离纯化 ꎬ 以进一步阐 释其机理 ꎮ 参考文献 : [１] 刘慧 ꎬ 秦小明 ꎬ 林华娟 ꎬ 等 .牡蛎蛋白酶解液脱腥技术的研究 [Ｊ].中国食品学报 ꎬ２０１２ꎬ１２(９):７８－８６. 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[２４] Ｄａｓ ＡꎬＳｉｎｈａ ＭꎬＤａｔｔａ Ｓꎬｅｔ ａｌ.Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｌａｓｔｉｃｉ￣ｔｙ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[ Ｊ].Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ１８５(１０):２５９６－２６０６. [２５] Ｄｕ ＹｕꎬＲｅｎ ＰｅｎｇꎬＷａｎｇ Ｑｉꎬｅｔ ａｌ.Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｔｔｅｎｕ￣ａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｍ１ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｍ２ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ[ Ｊ]. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎꎬ２０１８ꎬ１５:２５. [２６] Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ＮꎬＰｅｔｒｉｋ Ｊ ＪꎬＶｉｃｋａｒｙｏｕｓ Ｍ Ｋ.ＶＥＧＦꎬＦＧＦ－２ ａｎｄ ＴＧＦβ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｏｆ ｇｅｃｋｏｓ:ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｒｅｐｔｉｌｅｓ[Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙꎬ２０１８ꎬ２３２(５):７６８－７８２. [２７] Ｌｕ ＬｕꎬＷａｎｇ ＤｏｎｇｔａｏꎬＳｈｉ Ｙｉｎｇꎬｅｔ ａｌ.Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ ｆｒｏｍ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ－ ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄｅ－ｉｎ￣ｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ[Ｊ].Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃ￣ｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０１３ꎬ６１:７－１６. [２８] Ｃｈｏｉ Ｓ ＹꎬＫｉｍ Ｂ ＨꎬＨｕｈ Ｂ Ｋꎬｅｔ ａｌ.Ｔｒａｎｉｌａｓｔ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｕｔｕｒｅｓ ｔｏ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｓｃａｒｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－β ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ [Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１８ꎬ６７:４６９－４７７. [２９] Ｄｅｍｉｄｏｖａ－Ｒｉｃｅ Ｔ ＮꎬＨａｍｂｌｉｎ Ｍ ＲꎬＨｅｒｍａｎ Ｉ Ｍ.Ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｉｍ￣ｐａｉｒｅｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ: ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙꎬｐａｒｔ ２:ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏ￣ｌｏｇｉｃａｌ ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ:ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｌｉｖ￣ｅｒｙ[ Ｊ].Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｓｋｉｎ ＆ Ｗｏｕｎｄ Ｃａｒｅꎬ２０１２ꎬ２５(８):３４９ －３７０. [３０] Ｌｉ ＬａｋｅꎬＨａｉ ＪｉｅꎬＬｉ Ｚｈｉｑｉａｎｇꎬｅｔ ａｌ.Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｕｔｏｐｈ￣ａｇｙ ａｎｄ ＮＦ－κＢ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｎｏｎ－ａｌｃｏ￣ｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬ２０１３ꎬ ６３:１６６－１７３. [３１] Ｑｉｎ ＱｉａｏｊｉｎｇꎬＮｉｕ ＪｉａｎｇｙｉｎｇꎬＷａｎｇ Ｚｈａｏｘｉａꎬｅｔ ａｌ.Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍ￣ｂｒａｎａｃｅｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉ￣ｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ (ＭＡＰＫ) ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ (ＮＦ)－ｋａｐｐａ Ｂ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔ － ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｍａｃｒｏ￣ｐｈａｇｅｓ[Ｊ].Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１２ꎬ１３(７):８３７９－８３８７. [３２] Ｈｅ ＸｉａｏｊｕａｎꎬＮｉｕ ＸｕｙａｎꎬＬｉ Ｊｉａｎꎬｅｔ ａｌ.Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉ￣ｔｉｅｓ ｏｆｆｉｖｅｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｕｓｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ [ Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１２ꎬ２( １):１５－２７. [３３] Ｄｅｋｋｅｒ ＡꎬＤａｖｉｓ Ｆ ＭꎬＫｕｎｋｅｌＳＬꎬ ｅｔａｌ. Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ [ Ｊ ]. Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅ￣ ｓｅａｒｃｈꎬ２０１９ꎬ２０４:３９－５０. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｙｓｔｅｒｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ ＹＡＮＧ Ｆａ－ｍｉｎｇ１ꎬ ＬＩＮ Ｈａｉ－ｓｈｅｎｇ１ꎬ２ꎬ ＱＩＮ Ｘｉａｏ－ｍｉｎｇ１ꎬ２∗ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｏ－ｈｕａ１ꎬ２ꎬ ＣＡＯ Ｗｅｎ－ｈｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＧＡＯ Ｊｉａ－ｌｏｎｇ１ꎬ２ (１. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０８８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａ￣ｑｕａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙꎬ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎꎬ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｒａｎｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ (Ｚｈａｎｊｉａｎｇ)ꎬ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａ￣ｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０８８ꎬ Ｃｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ : Ｔｒａｃｅ ｒａｄｉａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｈａｌｆ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｏｙｓｔｅｒ (ＥＰＯ)ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ ｏｙｓｔｅｒ Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｓｉｋａｍｅａ ｂｙ ｃｒｕｓｈｉｎｇ ａｎｄ ｂｅａｔｉｎｇꎬ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｔ ａ ｄｏｓｅ ｏｆ １０００ Ｕ/ ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ５ ｈｏｕｒｓꎬ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＰＯ ｏｎ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｔａｉｌ ｗｏｕｎｄ. Ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｔｅｓｔꎬ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ＳＰＦ ｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ ｗｉｔｈ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ (２０±２)ｇ ｃｕｔ ｏｆｆ ａｂｏｕｔ ０.８ ｃｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎ ｗｅｒｅ ｓｍｅａｒｅｄ ｂｙ ３０－３５ ｍｇ ｏｆ ＥＰＯ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ １.５－２.５ ｍｇ (ｄｒｕｇ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｇｒｏｕｐ) ｄａｉｌｙꎬ ｂｙ ２－３ ｍｇ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｂａｉｙａｏ ｄａｉｌｙ (ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ) ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙ ｓｍｅａｒｉｎｇ (ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ) ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｗｏｕｌｄ ｈｅａｌｉｎｇ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＥＰＯ ｄｉｄ ｎｏｔ ｌｅａｄ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ １３ ｔｅｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｇｒａｍ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ. Ｔｈｅ ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｔｅｓｔｇｒｏｕｐ ｈａｄ ｃｒｕｓｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ２ｎｄ ｄａｙ. Ｏｎ ｔｈｅ ６ｔｈꎬ １０ｔｈ ａｎｄ １４ｔｈ ｄａｙꎬ ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｒａｔｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ (Ｐ <０.０５). Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＥＰＯ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６(ＩＬ－６) (Ｐ >０.０５)ꎬ ｗｉｔｈ ｐｒｏ￣ｍｏｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０(ＩＬ－１０) ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ (Ｐ <０.０５) ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｄａｙ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓꎬ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２(ＦＧＦ－２) ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｄｒｕｇ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ (Ｐ <０.０５). Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β(ＴＧＦ－β) ａｎｄ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１(ＣＣＮＤ１)ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ(Ｐ <０.０５)ꎬｗｉｔｈｏｕｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ(ＥＧＦ) ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｇｒｏｕｐ (Ｐ >０.０５). Ｏｎ ｔｈｅ ７ｔｈ ｄａｙ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ(Ｐ >０.０５)ꎬ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅ￣ｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ (Ｐ <０.０５) ｏｎ ｔｈｅ １４ｔｈ ｄａｙ. Ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ＥＰＯ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈａｓ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｓｃａｒ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｏｆ ａ ｍｉｃｅ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ : Ｃｒｏｓｓｏｓｔｒｅａ ｓｉｋａｍｅａ ꎻ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ ｓｍｅａｒꎻ ｓｋｉｎꎻ ｓｃａｒ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ