广西钦州牡蛎酶解产物促进小鼠皮肤创伤愈合效果研究大连海洋大学学报JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY第 34卷第 5期2 0 1 9年 1 0月Vol.34 No.5Oct . 2 0 1 9文章编号:2095-1388(2019)05-0649-07 大连海洋大学学报第34卷056 DOI :10.16535 / j.cnki.dlhyxb.2019-109 牡蛎酶解产物促进小鼠皮肤创伤愈合效果研究 杨发明 1ꎬ 林海生 1、2ꎬ 秦小明 1、2∗ꎬ 章超桦 1、2ꎬ 曹文红 1、2ꎬ 高加龙 1、2 (1??广东海洋大学食品科技学院 ꎬ 广东湛江 524088ꎻ 2??广东省水产品加工与安全重点实验室 ꎬ 广东普通高等学校水产品深加工 重点实验室 ꎬ 国家贝类加工技术研发分中心 (湛江 )ꎬ 南海生物资源开发与利用协同创新中心 ꎬ 广东湛江 524088) 摘要 :为探讨香港牡蛎 Crossostrea sikamea 酶解产物 (enzymolysis products of oysterꎬ EPO)对小鼠皮肤软组 织开放性创伤的愈合效果 ꎬ 构建直径约 0??8 cm 的小鼠 (体质量为 20 g±2 g)背部全皮层创伤模型 ꎬ 试验设 每天涂抹 30~35 mg EPO (肽含量为 1??5~2??5 mg)的给药组和每天涂抹 2~3 mg 云南白药的阳性对照组 ꎬ 以及不做任何处理的阴性对照组 ꎬ 采用体外抗菌 、体表促凝血和小鼠皮肤愈合试验 ꎬ 进行了 EPO 对小鼠皮 肤创伤愈合作用效果及作用阶段的研究 ꎮ 结果表明 : EPO 无促凝血作用 ꎬ 且对 13种常见革兰氏阴性和阳 性菌株无抑制作用 ꎻ 各试验组动物在第 2天时皆已结疤 ꎬ 第 6、 10、 14天时给药组创伤愈合率均显著高于 阴性对照组 (P <0??05)ꎻ EPO 可显著提高瘢痕收缩率 (P <0??05)ꎻ 生化指标测试结果显示 ꎬ EPO 对炎症因 子白介素 -6 (interleukin 6ꎬ IL-6)生成无显著性影响 (P >0??05)ꎬ 但第 3天时可显著促进白介素 -10 (in ̄terleukin 10ꎬ IL-10)分泌 (P <0??05)ꎻ 给药组碱性成纤维细胞生长因子 (FGF-2)含量显著低于两个对照 组 (P <0??05)ꎬ 转化生长因子 β (TGF-β)含量显著高于阴性对照组 (P <0??05)ꎬ 细胞生长周期素 1 (CC ̄ND1)含量显著高于两个对照组 (P <0??05)ꎻ 给药后第 7天 ꎬ 给药组羟脯氨酸含量较阴性对照组降低 ꎬ 第 14天时较阴性对照组升高 ꎬ 但均无显著性差异 (P >0??05)ꎮ 研究表明 ꎬ 涂抹 EPO 可以加快小鼠软组织开放 性创伤愈合 ꎬ 对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用 ꎮ 关键词 :香港牡蛎 ꎻ 酶解产物 ꎻ 涂抹 ꎻ 皮肤 ꎻ 瘢痕增生 中图分类号 : TS218ꎻ TS209ꎻ R641 文献标志码 : A 香港牡蛎 Crossostrea sikamea 广泛分布于中国 广东 、广西海域 ꎬ 其肉质鲜美 、营养丰富全面 ꎬ 素 有 “海洋牛奶 ”之美名 [1]ꎮ 牡蛎是第一批入选食 药同源的食物 ꎬ 其具有抗氧化 [2]、免疫 [3]、抗疲 劳 [4]、抗肿瘤 [5]、抑菌 [6]、改善记忆 [7]、解酒护 肝 [8]等功能活性 ꎬ 这为进行创伤愈合研究奠定了 理论基础 ꎬ 但尚未有对其进行深入的营养保健或药 用价值相关报道 ꎬ 因此 ꎬ 有必要对牡蛎的功能价值 进行充分开发利用 ꎮ 皮肤是人体最大的器官 ꎬ 结构复杂 ꎬ 可以保护 身体免受外部环境 、病原体和物理的侵害 [9]ꎮ 由 于皮肤总是暴露在外部环境中 ꎬ 故受伤概率较大 ꎮ 伤口通常是由正常组织的结构和功能被破坏引起 ꎬ 导致皮肤破裂造成身体伤害 ꎮ 创伤愈合是一个动态 的交互过程 ꎬ 包含止血 /炎症 、增殖和组织重塑 3个重叠阶段 ꎬ 这些阶段的任何异常都将导致慢性伤 口或严重的组织纤维化 [10]ꎮ 而治疗慢性伤口可能 较为持久 ꎬ 不仅需要特定的医疗技能 ꎬ 对当代医学 已构成巨大挑战 ꎬ 同时 ꎬ 全世界约有两千万人受慢 性伤口的困扰 ꎮ 由于人口老龄化 ꎬ 以及肥胖和糖尿 病等人群不断上升 ꎬ 这一数字可能会显著增加 [11]ꎮ 因此 ꎬ 加速创伤愈合对身体健康至关重要 ꎮ 传统的 创伤愈合活性物质 ꎬ 包括生长因子 、细胞因子 、从 植物中获得的化合物 ꎬ 以及其他免疫调节因子 ꎬ 都 难以将其转化成临床促愈疗法 [12]ꎮ 近年来 ꎬ 与高 成本且存在安全性和递送问题的药物相比 ꎬ 具有高 活性 、特异性和稳定性的生物活性肽在相关研究领 域引起了研究人员的兴趣 [13]ꎮ 随着国内外对海洋 来源活性肽功能作用的深入研究 ꎬ 已发现部分活性 肽在皮肤组织创伤愈合方面具有较高的潜在应用价 值 ꎬ 如海洋胶原蛋白肽 [14ꎬ5]、鱼皮胶原蛋白肽 [15]等 ꎮ 收稿日期 : 2019-05-08 基金项目 :国家现代农业产业技术体系专项 (CARS-49)ꎻ 广东海洋大学博士启动项目 (R17082)ꎻ 广东普通高等学校水产品高值化加工 与利用创新团队项目 (GDOU2016030503)ꎻ 广东省应用型科技研发专项资金项目 (2016B020235002) 作者简介 :杨发明 (1995—)ꎬ 男 ꎬ 硕士研究生 ꎮ E-mail:yangfm0123@ 163??com 通信作者 :秦小明 (1964—)ꎬ 男 ꎬ 教授 ꎮ E-mail:xiaoming0502@ 21cn??com 本研究中 ꎬ 采用可控酶法制备牡蛎酶解产物 (enzymolysis products ofoysterꎬ EPO)ꎬ 开展 EPO 促进小鼠皮肤软组织创伤愈合作用探讨 ꎬ 旨在为进 一步深入研究其机制提供理论参考 ꎮ 1 材料与方法 1??1 材料 试验用牡蛎肉购自广西钦州 ꎮ 试验用 SPF 级 昆明小鼠体质量为 (20±2) gꎬ 雄性 ꎬ 购自山东省 济南朋悦实验动物繁育有限公司 ꎬ 实验单位使用许 可证编号 SYXK (粤 ) 2014-0053ꎮ 云南白药购自 云南白药集团 ꎮ 抗菌试验所需菌株由广东省水产品 加工与安全重点实验室提供 ꎮ 试验试剂 :动物蛋白酶 (3万 U/ g)购自广西 南宁庞博生物工程有限公司 ꎻ 白介素 -6 (interleu ̄kin 6ꎬ IL-6)、白介素 -10 (interleukin 10ꎬ IL-10)、生长因子转化生长因子 β ( transforming growth factor-βꎬ TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因 子 (fibroblastgrowth factor 2ꎬ FGF-2)、表皮细胞 生长因子 (epidermal growth factorꎬ EGF)、细胞生 长周期素 1 (Cyclin D1ꎬ CCND1)和羟脯氨酸测定 试剂盒购自南京建成生物工程研究所 ꎮ 试验仪器 : Lynx 6000型高速冷冻离心机 、多 功能酶标仪购自 Thermo 公司 ꎻ BSA224S-CW 型万 分之一电子天平购自赛多利斯科学仪器 (北京 )有限公司 ꎻ FE28型 pH 计购自梅特勒 —托利多仪 器 (上海 )有限公司 ꎻ DF-101T 集热氏恒温加热 磁力搅拌器购自上海精宏实验设备有限公司 ꎻ FDU-1110型冷冻干燥机购自上海爱朗仪器有限公 司 ꎻ SW-CJ-2FD 型双人超级操作台 ꎬ 苏州净化设 备有限公司 ꎮ 1??2 方法 1??2??1 EPO 制备工艺 将牡蛎肉清洗 、打浆 ꎬ pH 值调至 7??0ꎬ 加入 1000 U/ g (蛋白 )的动物蛋白 酶 ꎬ 酶解 5 hꎬ 灭酶 10 minꎬ 以 8000 r/min 离心 ꎬ 浓缩 ꎬ 冷冻干燥 [16]ꎮ 采用凯氏定氮法 [17]、甲醛滴 定法 [17]和双缩脲法分别测定蛋白质含量 、水解度 和肽含量 ꎮ 1??2??2 EPO 体外抗菌试验 采用微量径向扩散法 和半数稀释法 [18]测定 EPO 对 6中革兰氏阳性菌和 7种革兰氏阴性菌的抗菌活性 ꎮ 1??2??3 EPO 体表促凝血试验 用断尾法 [19]测定 EPO 对小鼠体表创口出血时间和出血量的影响 ꎮ 1??2??4 EPO 急性皮肤毒性试验 选取 SPF 级昆明 小鼠 10只 ꎬ 随机分成空白对照组和 EPO 涂抹组 ꎮ 试验方法参考文献 [20]ꎮ 1??2??5 动物分组及创伤模型建立 选取 SPF 清洁 级昆明雄性小鼠 60只 ꎬ 随机分为 3组 ꎬ 每组 20只 ꎬ 分别为阴性对照组 、云南白药阳性对照组和 EPO 给药组 ꎮ 将小鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉后 ꎬ 背部剃毛 、消毒 ꎮ 在小鼠背部剪去直径约 0??8 cm 的全层皮肤 ꎬ 造成全皮层创伤动物模型 ꎮ 每只小鼠 均分笼饲养 ꎬ 给药组每天涂抹 30~35 mg EPO (肽 含量为 1??5~2??5 mg)ꎬ 阳性对照组每天涂抹 2~3mg 云南白药 ꎬ 阴性对照组不做任何处理 ꎮ 每 2天 对小鼠创伤口面观察 、拍照 、测量伤口大小 ꎬ 并记 录结果 ꎮ 1??2??6 愈合率及瘢痕缩小率 每隔 2 d 用游标卡 尺测量创面直径大小一次 ꎬ 计算创伤愈合率 : 瘢痕缩小率 = (第 0天创面直径 -第 14天瘢痕 长度 ) /第 0天创面直径 ×100%ꎮ 1??2??7 瘢痕组织中生化指标测定 小鼠创面组织 匀浆液制备参考文献 [21]ꎬ 分装于 -80 ℃下保藏 待测 ꎮ IL-6、 IL-10、 TGF-β、 FGF-2、 EGF、 CC ̄ND1和羟脯氨酸含量的检测均按照试剂盒说明书 进行 ꎮ 1??3 数据处理 试验数据采用平均值 ±标准差表示 (mean±S??D??)ꎬ 每组试验至少重复 3次 ꎬ 采用 SPSS 20软 件进行统计学分析 ꎮ 组间比较采用 LSD 检验 ꎬ 显 著性水平设为 0??05ꎮ 2 结果与分析 2??1 牡蛎酶解产物 (EPO )的基本性质 本试验中自制的 EPO 主要质量指标为加酶量 为 1000 U/ gꎬ 蛋白的牡蛎酶解液水解度为 26??33%ꎬ EPO 的蛋白质含量为 43??54 g /100 gꎬ 肽 含量为 25??26%ꎮ 2??2 体外抗菌试验结果 采用微量径向扩散法和半数稀释法测定 EPO 对常见的 13种菌株的抑制作用 ꎬ 其中 6种革兰氏 阳性菌株分别为金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus au ̄reus 、芽孢杆菌 Bacillus 、李斯特菌 Listeria monocy ̄ togenes 、海豚链球菌 Streptococcusiniae 、格氏乳球 菌 Lactococcus garviea 和无乳链球菌 Streptococcus agalactiae ꎬ 7种革兰氏阴性菌分别为大肠杆菌 Escherichia coli 、铜绿假单胞菌 Pseudomonas aerugi ̄nosa 、溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus 、副溶血性弧菌 V ??Parahemolyticus 、海藻希瓦氏菌 Shewanella algae 、哈氏弧菌 V ??harveyi 和嗜水气单胞菌 Aeromonas hy ̄drophila ꎮ 体外抗菌试验结果显示 ꎬ EPO 无抗菌活 性 ꎮ 2??3 体表促凝血试验结果 EPO 对小鼠体表创口出血时间和出血量的影 响如表 1所示 ꎬ 与阴性对照组相比 ꎬ EPO 可缩短 出血时间和减少出血量 ꎬ 但无显著性差异 (P >0??05)ꎬ 而云南白药阳性对照组则极显著好于其他 组 (P <0??01)ꎮ 这表明 ꎬ EPO 不具有促凝血作用 ꎮ 表 1 EPO 对小鼠断尾创口出血时间和出血量的影响 (n =5) Tab??1 Effect of EPO on bleeding time and blood loss of mouse tail wound (n =5) 组别 group 出血时间 /min bleeding time 出血量 / g amount of bleeding 阴性对照组 negative control 5??05±0??79 0??0152±0??0019 阳性对照组 positive control 0??94±0??49∗∗ 0??0054±0??0017∗∗ 给药组 administration 4??33±0??79 0??0144±0??0011 注 : ∗∗表示与阴性对照组有极显著性差异 (P <0??01) Note: ∗∗means very significant difference compared with the negative control (P <0??01) 2??4 EPO 急性皮肤毒性试验结果 连续涂抹 EPO 3 d 后 ꎬ 所有小鼠均未出现红斑 和水肿现象 ꎮ 停药后继续观察 2 dꎬ 也未出现红斑 和水肿 ꎬ 且均未出现动物体质量下降 、站立不稳 、精神萎靡等其他异常变化 ꎮ 这表明 ꎬ EPO 对小鼠 无毒性 ꎮ 2??5 EPO 对小鼠皮肤伤口愈合作用的影响 2??5??1 创面形态变化观察 各组愈合情况如图 1所示 ꎬ 造模后第 2天 ꎬ 各试验组动物皆已结痂 ꎬ 伤 口周围出现红肿 ꎬ 无液体渗出 ꎬ 伤口收缩均不明 显 ꎮ 第 2、 4天时 ꎬ 各组创面结痂局部不断变硬 ꎬ 创伤周围表面不平整 ꎬ 创缘皮肤收缩较明显 ꎮ 第 6、 8、 10天时 ꎬ 阴性对照组伤口结痂不断变厚 ꎬ 呈黑红色 ꎬ 但瘢痕面积变化小 ꎻ 阳性对照组伤口缩 小 ꎬ 并开始部分脱痂 、缩痂明显 ꎻ EPO 给药组在 第 6天时已掉痂 ꎬ 缩痂明显优于两对照组 ꎮ 第 12天时 ꎬ 各组皆已掉痂 ꎬ 愈合处开始长出毛发 ꎬ 其中 给药组进一步缩痂 ꎮ 第 14天时 ꎬ 阴性对照组的多 数伤口直径小于 2 mmꎬ 各给药组伤口直径均小于 1 mmꎬ 呈现肉红色新生皮肤 ꎬ 新生肉色组织完整 ꎮ 给药组较阴性对照组愈合情况良好 ꎬ 无增生性瘢痕 及瘢痕疙瘩生成 ꎮ 2??5??2 愈合率 从表 2可见 :造模后第 6天时 ꎬ EPO 给药组的伤口愈合率均在 35%以上 ꎬ 与阴性 对照组相比 ꎬ 高出 21% (P <0??05)ꎻ 造模后第 10天时 ꎬ 给药组显著高于阴性对照组 (P <0??05)ꎬ 高 出 40%ꎻ 第 14天时 ꎬ 给药组愈合率达 94??17%ꎬ 较 图 1 EPO 对小鼠创面的影响 Fig??1 Effect of EPO on wound of mice 阴性对照组高出 14% (P <0??05)ꎮ 由图 2可知 ꎬ 给药组瘢痕缩小率显著高于阴性 对照组 (P <0??05)ꎮ 给药组和阳性对照组在创伤愈 合时期 ꎬ 创伤愈合速率均显著高于阴性对照组 (P <0??05)ꎬ 但给药组与阳性对照组相比无显著性 差异 (P >0??05)ꎮ 创伤愈合后期 (14 d)ꎬ 各试验 组创伤愈合速率逐渐趋于平衡 ꎬ 给药组效果突出 (表 2云 )ꎮ 南白药 (粉 )是中国最著名的专利药之一 ꎬ 主要由中草药三七 [22]开发 ꎬ 传统上用于止血和改 善创伤性损伤的循环 [23]ꎮ 其中三七皂苷表现出抗 炎 、抗糖尿病 、抗氧化和抗肿瘤特性 ꎬ 所以云南白 药 (粉 )可能是通过加快止血 ꎬ 促进血液循环和 消炎作用以实现促进创伤愈合 ꎮ 虽然阳性对照组与 给药组创伤愈合速率无显著性差异 ꎬ 但 EPO 给药 组效果更好 ꎬ 瘢痕较小 ꎬ 几乎达到无痕状态 ꎮ 成分 检测结果显示 ꎬ EPO 主要成分是蛋白质 ꎬ 而其中 肽含量较高 ꎬ 且具有膜透过性好 、激活细胞活性 、修复人体变性细胞等生物活性 [18]ꎬ 推测 EPO 具有 相关功能活性肽并起主要作用 ꎮ 表 2 EPO 对小鼠皮肤创伤愈合的影响 (愈合率 ) Tab??2 Effect of EPO on skin wound healing (healing rate ) in mice % 组别 group 0 d 6 d 10 d 14 d 阴性对照 negative control 0 14??17±2??89b 35??86±8??66b 80??42±6??17b 阳性对照 positive control 0 35??83±6??88a 56??67±17??02a 92??92±6??41a 给药组 administration 0 35??83±12??27a 75??00±4??33a 94??17±10??10a 注 :同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异 (P <0??05)ꎬ 标有相同字母者表示组间无显著性差异 (P >0??05)ꎬ 下同 Note: The means with different letters within the same column are significant differences at the 0??05 probability levelꎬ and the means with the same letters within the same column are not significant differencesꎬ et sequentia 组别 group 注 :标有不同字母者表示组间有显著性差异 (P <0??05)ꎬ 标有 相同字母者表示组间无显著性差异 (P >0??05) Note: The means with different letters are significant differences at the 0??05 probability levelꎬ and the means with the same letters are not significant differences 图 2 EPO 对小鼠皮肤创伤瘢痕生成的影响 Fig??2 Effect of EPO on scar formation of skin wounds in mice 2??5??3 炎症因子测定 根据环境刺激 ꎬ 巨噬细胞 具有广泛的功能 ꎬ 特别是通过释放多种因素来调节 先天免疫反应 ꎮ 目前 ꎬ 巨噬细胞已被初步分为分泌 IL-6等促炎症因子的 M1型和分泌 IL-10等抗炎症 因子的 M2型 [24]两个主要表型 ꎮ 于是 ꎬ 本研究中 选择造模后第 3、 5、 7天时的 IL-6与 IL-10含量 进行测定 ꎬ 结果如图 3和图 4所示 ꎮ 从图 3可见 :第 3、 7天时 ꎬ 给药组 IL-6含量 与两个对照组均无显著性差异 (P >0??05)ꎻ 第 5天 时 ꎬ 阳性对照组与阴性对照组有显著性差异 (P <0??05)ꎮ 这表明 ꎬ EPO 对小鼠创伤皮肤组织中炎症 因子 IL-6含量生成无影响 ꎮ 时间t i me /d 注 :同一时间下 ꎬ 标有不同字母者表示组间有显著性差异 (P <0??05)ꎬ 标有相同字母者表示组间无显著性差异 (P >0??05)ꎬ 下同 Note: The means with different letters within the same time are sig ̄nificant differences at the 0??05 probability levelꎬ and the means with the same letters within the same time are not significant differencesꎬ et sequentia 图 3 EPO 对创伤皮肤组织中炎症因子 IL-6含量的影 响 Fig??3 Effect of EPO on levels of inflammatory factor IL-6 in wound skin tissue 从图 4可见 :第 3天时 ꎬ 给药组和阳性对照组 IL-10含量均显著高于阴性对照组 (P <0??05)ꎻ 第 5天时 ꎬ 阳性对照组 IL-10含量显著高于其他组 (P <0??05)ꎻ 第 7天时 ꎬ 阳性对照组和给药组 IL-10含量均显著低于阴性对照组 (P <0??05)ꎮ Du 等 [25]报道 ꎬ M1巨噬细胞的浸润在损伤后 第 1天时炎症因子显著增加 ꎬ 在第 3天时达到峰 值 ꎬ 随后降低 ꎻ M2巨噬细胞的数量在第 3天时也 迅速增加 ꎬ 在第 5天时达到最大值 ꎬ 在第 7天和第 9天时逐渐减少 ꎬ 而 M2巨细胞在损伤后第 5天时 图 4 EPO 对创伤皮肤组织中抗炎症因子 IL-10含量 的影响 Fig??4 Effect of EPO on levels of anti-inflammatory factor IL-10 in wound skin tissue 取代 M1巨噬细胞作为伤口中的主要巨噬细胞 ꎮ 本 研究结果与此研究结果一致 ꎮ 2??5??4 生长因子 FGF-2具有有效的促血管生成 功能 ꎬ 并参与各种细胞功能 ꎬ 包括应激后的分化 、迁移 、增殖等作用 [26-27]ꎮ TGF-β 是一种主要的细 胞因子 ꎬ 参与瘢痕组织中发生的过度胶原合成 ꎬ 还 可通过增强细胞迁移和信号传导起到帮助伤口愈合 的良性作用 [28-29]ꎮ CCND1主要功能是促进细胞增 殖 [30-31]ꎮ EGF 促进创面愈合最主要的作用是促进 创面组织的增殖和分化 ꎬ 增殖和分化形成的新细胞 代替衰老和已经死亡的细胞 [32]ꎮ 从表 3可见 ꎬ 给药组 FGF-2含量显著低于两 个对照组 (P <0??05)ꎬ TGF-β 含量显著高于阴性 对照组 (P <0??05)ꎬ CCND1含量显著高于两个对 照组 (P <0??05)ꎬ 而 EGF 含量高于阴性对照组 ꎬ 但无显著性差异 (P >0??05)ꎮ 由此可以推测 ꎬ EPO 促进创面愈合的过程中通过加速细胞因子 TGF-β 的分泌促进成纤维细胞分泌胶原 、增加胞外基质沉 积 、促进新血管形成及表皮细胞生长 ꎮ 同时 ꎬ 也通 过加速细胞周期调控蛋白 CCND1的表达促进成纤 维细胞等细胞周期向分裂期转化 ꎬ 从而加速细胞的 有丝分裂以实现同愈合率结果一致的创伤愈合 ꎮ 这 表明 ꎬ 涂抹 EPO 在增殖期可通过促进 TGF-β 和 CCND1的分泌 ꎬ 从而加快小鼠皮肤创伤愈合 ꎮ 表 3 EPO 对创伤皮肤组织中生长因子的影响 Tab??3 Effect of EPO on growth factors in wound skin tissue ng /mL 组别 成纤维细胞生长因子 2 FGF-2 转化生长因子β TGF-β 细胞生长周期素 CCND1 表皮生长因子 EGF group 阴性对照组 negative control 36??58±2??65a 0??44±0??04a 1??67±0??50a 131??37±59??51a 阳性对照组 positive control 28??72±5??65a 1??55±0??11b 2??74±1??21a 1674??34±913??78b 给药组 administration 26??51±4??77b 1??57±0??08b 8??03±0??20b 340??88±144??97a 2??5??5 羟脯氨酸含量 创伤愈合的最后阶段是重 塑阶段 ꎬ 成纤维细胞分化成收缩的肌成纤维细胞 ꎬ 其收缩伤口并且在增殖期期间沉积的胶原蛋白 Ⅲ被 交换为具有更高拉伸强度的胶原蛋白 Ⅰꎬ 加快创面 组织中胶原蛋白与其他蛋白质分子形成紧密的交 联 [33]ꎬ 可通过测定羟脯氨酸含量来反映胶原蛋白 含量的变化情况 ꎮ 从表 4可见 :造模后第 7天时 ꎬ 给药组羟脯氨 酸含量低于阴性对照组但无显著性差异 (P >0??05)ꎬ 略高于阳性对照组 (P >0??05)ꎻ 造模后第 14天时 ꎬ 给药组羟脯氨酸含量高于阴性对照组 ꎬ 但给药组与两个对照组间均无显著性差异 (P >0??05)ꎮ 这表明 ꎬ EPO 具有一定促进胶原蛋白的分 泌 、沉积和交联的作用 ꎮ 这与创面愈合照片 、愈合 率 、瘢痕缩小率和 FGF-2含量结果一致 ꎬ 但羟脯 氨酸含量测定结果并不理想 ꎬ 在后续试验中可通过 调整测定指标进行进一步的验证和阐释 ꎮ 3 结论 本研究中针对皮肤创伤愈合全阶段试验指标的 表 4 EPO 对创伤皮肤组织中羟脯氨酸含量的影响 Tab??4 Effect of EPO on hydroxyproline level in wound skin tissue μg/mL 组别 group 7 d 14 d 阴性对照组 negative control 7??58±0??00ab 13??10±2??11b 阳性对照组 positive control 4??60±0??99a 23??86±2??73a 给药组 administration 5??46±1??94bc 19??06±0??54a b 选择 ꎬ 进行体外试验及涂抹给药的动物试验 ꎬ 结果 表明 ꎬ 在皮肤创伤愈合过程中 ꎬ 涂抹牡蛎酶解产物 通过抑制炎症作用 ꎬ 促进生长因子分泌及胶原蛋白 的沉积与交联 ꎬ 从而加快了小鼠软组织开放性创伤 愈合 ꎬ 且对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用 ꎮ 本 研究发现并开拓了皮肤创伤愈合活性物质的来源 ꎬ 但其具体作用功能因子尚不确定且机理不明 ꎬ 后续 试验将对牡蛎酶解产物进行分离纯化 ꎬ 以进一步阐 释其机理 ꎮ 参考文献 : [1] 刘慧 ꎬ 秦小明 ꎬ 林华娟 ꎬ 等 .牡蛎蛋白酶解液脱腥技术的研究 [J].中国食品学报 ꎬ2012ꎬ12(9):78-86. 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Guangdong Provincial Key Laboratory of A ̄quatic Products Processing and Safetyꎬ Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institutionꎬ National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing (Zhanjiang)ꎬ South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collabora ̄tive Innovation Centerꎬ Zhanjiang 524088ꎬ China) Abstract : Trace radial diffusion method and half dilution method were used to investigate in vitro the antibacterial effects of enzymolysis products of oyster (EPO)prepared from Hong Kong oyster Crassostrea sikamea by crushing and beatingꎬ and enzymatic hydrolysis of animal protease at a dose of 1000 U/ g protein for 5 hoursꎬ and effects of the EPO on bleeding time and blood loss of mouse tail wound. In the open wound healing testꎬ the skin soft tissue of SPF male mouse with body weight of (20±2)g cut off about 0.8 cm in diameter from the dorsal skin were smeared by 30-35 mg of EPO containing peptide of 1.5-2.5 mg (drug-administered group) dailyꎬ by 2-3 mg of Yunnan Baiyao daily (positive control) and without any smearing (negative control) to investigate the effects of EPO on the open soft tissue would healing. The results showed that EPO did not lead to promote procoagulant effect and inhibitory effect on 13 test common gram and positive bacteria. The animals in each testgroup had crusted on the 2nd day. On the 6thꎬ 10th and 14th dayꎬ howeverꎬ significantly higher wound healing rate was observed in the drug-administered group than that in the negative control group (P <0.05). Biochemical indicators showed that EPO had no significant effect on the production of inflammatory factorinterleukin 6(IL-6) (P >0.05)ꎬ with pro ̄moting interleukin 10(IL-10) secretion (P <0.05) on the third day. Compared with the two controlgroupsꎬ there was significantly lower fibroblast growth factor 2(FGF-2) content in drug-administered group than that in the two control groups (P <0.05). The transforming growth factor-β(TGF-β) and cyclin D1(CCND1)contents were shown to be significantly higher in the drug-administered group than that in the negative control groups(P <0.05)ꎬwithout significant difference in the epidermal growth factor(EGF) content in the drug-administered group (P >0.05). On the 7th day after administrationꎬ there was lower hydroxyproline content in the drug-administered group than that in negativecontrol(P >0.05)ꎬ elevated hydroxyprolin content in the negative controlꎬ without significant difference be ̄tween the two groups (P <0.05) on the 14th day. The findings indicate that EPO functions as acceleration of wound healing in soft tissue of mouse and has a certain inhibitory effect on superficial scar hyperplasia of a mice. Key words : Crossostrea sikamea ꎻ enzymolysis productꎻ smearꎻ skinꎻ scar hyperplasia