LCMS-8050测定原料乳中残留兽药的方法

使用LC-MS/MS开发了一种简单、灵敏、快速的方法定量测定牛奶中的兽药残留。基于Shimadzu LC-MS/MS开发的方法被证明具有高灵敏度及较好的重现性，大多数化合物在痕量水平下显示出良好的RSDr和RSDR（根据SANTE指南REF2）。该方法稳定、可靠，能够根据FSSAI法规用于在实验室中检测牛奶样品。岛津SHIMADZU Application News表3仪器配置和分析条件： LC-MS/MS 液相色谱质谱仪LCMS-8050 LCMS-8050 测定原料乳中的残留兽药 Nit in Shukla' ， Su j it Patil ， Du r vesh Sawant， AseemWagle ， Jitendra Kelkar'， P ratap Rasam 1 Sh i madzu An a lytical (India) Pvt.Ltd， A/B Ru s h a bh Chamber s ， Makwana Road， Marol， Andher i East， Mumbai-400059 特点描述 ◆改良的 QuEChERS 和 SPE 与 L CMS-8050 超快速技术相结合，用于定量检测痕量兽药残留。 ◆方法涵盖具有不同化学性质的药物种类 ◆分析时间更短，更高通量分析。 简介 在奶牛养殖中使用兽药对于奶牛疾病的预防和治疗非常重 要。然而，由于药物的滥用或停药期使用，兽药可能残留在生 鲜乳中。因为牛奶是饮食中的重要食物，这可能使消费者产生 健康问题，尤其是对于婴儿和儿童。因此，为了确保乳制品的 安全，已加强对食品中兽药残留的安全监管。为了满足这些严 格的监管要求，亟需一种高灵敏度的定量方法。本研究的目的 是开发一种可涵盖各种不同兽药的高灵敏度分析方法。 基于这些要求，岛津使用 LCMS-8050 开发并验证了4种简 单、灵敏、高通量的牛奶中多兽药残留的检测方法。(总共69种化合物)。用改良 QuEChERS"方法和 SPE 进行萃取。方法I 涵盖44种化合物，方法Ⅱ涵盖15种化合物，方法Ⅲ涵盖4种 化合物，方法Ⅳ涵盖6种化合物。不同法规涵盖的兽药数量见 表1。 表 1各法规涵盖的 兽 药 合规性/法规 受监管的药物数量 本方法涵盖的药物数量 FSSAI 97 48 EU 82 30 材料和方法 对照品购自 Sigma。 牛奶样品购自当地市场，用于制备基质匹配的校准曲线及 加标样品。 图 1 S h im a d z u L CMS-8050 在表2给出的范围内制备校准曲线。 表 2校 准曲线范围 方法1 方法Ⅱ 方法Ⅲ 方法I 1至50 ug/L 2至50 ug/L 1至50 ug/L 2至50 ug/L 通过外标法和 1/C ²的加权回归绘制标准曲线。各LOQ和 2×LOQ制备六份平行的加标样品，达到的LOQ 低于 MRL (参 见表4)。 使用 Nexera X3 和 Shimadzu LCMS-8050 (图1，岛津制作 所)定量测定牛奶样品中的兽药残留。 岛津用于兽药测定的LC-MS/MS方法包(第2版)和用于 氨基糖苷类抗生素测定的LC-MS/MS 方法包可实现快速仪器方 法优化，从而提高通量。对于大多数化合物，方法中包括 1个 定量和2个定性 MRM 通道。 岛津的数据处理软件 LabSolutions Insig ht TM 用于数据处理，这有助于轻松评价验证参数。 样品制备 本研究使用了4种不同的萃取方法，其中采用了改良的 QuEC h ERS 方法和 SPE 。方法I：样品用乙腈去蛋白，加入无水 MgSO和 NaCI 进行分离并离心。使用 C18进行 dS P E 净化，用 氮气吹干溶液后，用流动相复溶进样。 方法Ⅱ：样品加入磷酸氢二钠缓冲液后，用乙腈去蛋白。加 入无水 NaSO和 NaC I 进行分离并离心。 使用 C18 进行 dSPE 净化。用氮气吹干溶液后，用流动相 复溶进样。 方法Ⅲ：样品用三氯乙酸去蛋白并离心。上清液通过 HLB柱 ，用甲醇洗脱并用流动相稀释后上样。 方法Ⅳ：样品用离子对试剂稀释，过滤后上样。所有样品 分别在表3所示的条件下进行分析。 系统配置 LC-MS/MS ：LCMS-8050 自动进样器 ： Nexera X3 和 SIL-40C 色谱柱 ： Shim-packTM Velox C18， P/N 227-32010-03 (3.0 mmi.d. ×100 mm， 2.7 um) 方法1和Ⅱ 流速 ： 0.3 mL/min 流动相A ：0.1%甲酸水溶液 流动相B ：甲醇 梯度程序 ： 5%B (0.0 min至1.0 min)→5-80%B (1.0 min 至6.5 min) →80-80%B (6.5 min 至7.5 min) →80-100%B(7.5 min 至9.0 min)→100-100%B (9.0 min 至12.5 min) →100-5%B(12.5 min 至13.0 min) 运行时间 ：17 min 进样量 ： 10pL(与水同时注入) 柱温箱温度 ：40℃ 方法I 流速 ： 0.3 mL/min 流动相A ：0.2% HFBA水溶液 流动相B ：甲醇 梯度程序 ：10-95%B (0.0 min 至6.0 min)→95- 95%B (6.0 min 至 7.0 min)→95- 10%B (7.0 min至8.0 min)→10- 10%B (8.0 min 至12.0min) 运行时间 ：17min 进样量 ：10pL 柱温箱温度 ：40℃ 方法Ⅲ 流速 ： 0.3 mL/min 流动相A ：0.1%甲酸水溶液 流动相B ：甲醇 梯度程序 ： 5%B (0.0 min 至1.0 min)→5-80%B (1.0 min 至6.5 min)→80-80%B(6.5 min 至7.5 min)→80-100%B(7.5 min 至9.0 min)→100-100%B (9.0 min 至 12.5 min) →100-5%B (12.5 min 至13.0 min) 运行时间 ：17 min 进样量 ：10pL(与水同时注入) 柱温箱温度 ：40℃ MS 离子化 ：ESI 雾化气流量 ：3L/min 加热气流量 ：8L/min 干燥气流量 ：8L/min 接口温度 ：250°℃ DL 温度 ：200°℃ 加热模块温度 ：350°C 结果与讨论 我们根据 SANTE 指南研究了其专属性、线性、回收率和精 密度等方法学参数 。得到的结果如表4所示。FSSAI和 EU管 制的化合物分别用#和*标记。 系统精密度和专属性 10 ug/L 的兽药混合溶剂标样，重复进样6次，计算方法峰 面积和保留时间的RSD% 来评价系统精密度。 所有化合物的峰面积的RSD% 小于20%，保留时间在 ±0.1 mi n 的容许限度内。通过将空白样品(试剂和基质)的响 应值与报告水平进行比较，确定方法的专属性。试剂/基质空白 样品的响应值在报告限度的30%以内，符合可接受标准。 校准曲线 我们在研究中使用的是基质匹配校准曲线。根据 SANTE 指 南，所有校准点的准确度均在80%至120%之间。部分代表性 化合物的线性曲线如图2所示。 回收率 通过分析 LOQ和2XLOQ(每个水平六份重复样品)的加 标样品与基质匹配校准曲线的响应来评价回收率。大多数化合 物的平均回收率在 70-120%范围内。根据 SANTE 指南，所有 化合物在 LOQ水平下重现性良好。 精密度 对于精密度，进行了重复性和实验室内重现性研究。根据 基质匹配标准曲线计算加标样品的浓度。 重复性 (RSDr)： LOQ 和 2×LOQ 浓度水平的兽药标准品混样，重复进样 6次考察重复性。各LOQ水平6次进样的重复性RSD% 均 ≤20%。 (见表4) 重现性 (RSDR)： 在 L OQ 和 2×LOQ 浓度水平下，对六份不同的加标样品进 行了回收率重现性实验。各 LOQ水平加标样品的回收率RSD%均 ≤20%。 (见表4) 表4结果汇总 化合物名称 保留时间 (min) 定量离子通道 CE检测方法 LOQ (mg/kg) LOQ 下的回 收率(%) EU MRL (mg/kg) FSAAI MRL (mg/kg) 精密度 (m/z) RSDR% (n=6) RSDr% (n=6) *阿苯达唑-2-氨基砜 4.29 240.00>132.95 -27 1 0.002 82.8 0.1 NA 7.67 3.52 *阿苯达唑砜 6.26 298.00>158.90 -37 1 0.002 88.56 0.1 NA 4.53 6.39 *阿苯达唑亚砜 6.04 282.20>239.90 -14 1 0.002 87.19 0.1 NA 12.33 6.82 *#氨苄西林 5.14 350.10>106.00 -22 1 0.002 52.7 0.004 0.01 14.4 16.57 #氨丙啉 1.57 242.95>150.00 -12 1 0.002 75.56 NA 0.01 10.68 8.63 *#头孢噻呋 6.39 524.00>241.00 -16 0.005 80.84 0.1 0.1 15.43 6 #氯羟吡啶 4.69 192.10>100.90 -26 1 0.005 101.13 NA 0.01 10.59 11.73 *#氯唑西林 6.01 435.50>98.90 -22 1 0.002 76.76 0.03 0.01 18.88 14.01 *双氯西林 7.76 470.10>159.90 -16 0.002 88.56 0.03 NA 10.62 11.28 #三氮脒 6.04 282.20>239.85 -14 0.002 86.98 NA 0.15 7.13 6.76 *#恩诺沙星 4.92 360.05>315.95 -19 1 0.005 41.37 0.1 0.01 19.1 5.39 *红霉素A 6.88 734.35>158.05 -30 1 0.002 70.27 0.04 NA 4.08 4.62 #乙氧酰胺苯甲酯 6.83 237.90>135.95 -26 0.002 83.8 NA 0.01 15.35 6.58 *#非班太尔 8.05 447.10>198.90 -20 0.002 80.01 0.01 0.1 10.47 4.97 *#芬苯达唑砜 6.8 332.20>299.85 -22 0.002 78.51 0.01 0.1 7.21 6.7 *#氟尼辛 6.27 297.60>158.90 -35 0.002 102.42 0.04 0.01 8.57 13.9 #常山酮 6.26 414.00>100.00 -22 0.002 62.54 NA 0.01 17 6.21 *#林可霉素 4.51 407.10>126.00 -30 0.002 51.21 0.15 0.15 6.88 3.6 #美吡拉敏 5.63 286.30>120.95 -22 0.002 109.33 NA 0.01 9.45 23.91 甲硝唑 3.8 172.30>127.90 -16 0.002 88.67 NA NA 8.12 4.56 *莫仑太尔 5.11 221.10>77.00 -41 1 0.002 82.73 0.05 NA 11.65 13.62 #尼美舒利 7.76 306.80>121.95 36 0.002 72.5 NA 0.01 12.2 8.52 *#硝碘酚腈 7.23 288.70>162.15 22 0.002 91.48 0.02 0.01 9.84 15.21 *#奥芬达唑 6.67 316.10>158.90 -32 1 0.002 79.66 0.01 0.1 5.56 3.89 *#氯羟柳胺 4.87 398.10>380.85 -12 0.005 44.48 0.01 0.01 19.43 19.88 苯基丁氮酮 1.52 309.10>152.80 -21 1 0.002 58.31 NA NA 3.6 2.39 #吡喹酮 8.11 313.10>203.00 -17 1 0.002 79.14 NA 0.01 8.81 7.25 #丙嗪 6.76 285.10>85.95 -19 1 0.002 46.9 NA 0.01 18.99 6.21 *螺旋霉素1 5.51 422.20>101.00 -18 0.002 75.75 0.2 NA 19.67 11.51 #磺胺嘧啶 3.94 251.15>155.95 -15 1 0.002 96.04 NA 0.01 18.98 14.49 磺胺二甲氧嘧啶 4.97 279.00>185.90 -17 0.002 70.69 NA NA 14.81 19.77 #磺胺二甲嘧啶 1.54 215.15>137.20 -10 1 0.002 94.22 NA 0.025 7.26 6.77 磺胺胍 4.5 265.00>155.90 -16 1 0.002 57.35 NA 0.01 1.89 0.65 磺胺甲嘧啶 5.31 254.15>91.95 -26 1 0.005 75.03 NA NA 12.81 18.56 磺胺甲恶唑 5.06 281.15>155.90 -17 1 0.002 72.35 NA NA 16.13 19.87 #磺胺甲氧嘧啶 4.16 255.80>155.90 -14 1 0.002 79.99 NA NA 11.57 14.44 #磺胺吡啶 6.18 311.20>155.95 -20 0.002 84.29 NA NA 7.25 10.51 磺胺噻唑 4.3 250.15>107.95 -26 1 0.002 81.52 NA 0.01 19.91 16.78 #泰妙菌素 6.72 494.25>192.00 -21 1 0.002 79.19 NA 0.01 5.95 1.82 *替米考星(异构体) 6 869.40>173.95 -45 1 0.002 76.68 0.05 NA 6.4 9.09 替硝唑 4.55 248.00>120.90 -16 0.002 93.27 NA NA 19.42 9.21 表4结果汇总(续) 化合物名称 保留时间 (min) 定量离子通道 检测方法 LOQ (mg/kg) LOQ 下的回 收率(%) EU MRL (mg/kg) FSAAI MRL (mg/kg) 精密度 (m/z) CE RSDR% (n=6) RSDr% (n=6) *#甲氧苄啶 4.51 290.95>230.00 -24 1 0.002 82.86 0.05 0.01 5.71 3.9 *泰乐菌素 6.82 916.50>174.00 -39 0.002 81.73 0.05 NA 12.67 11.62 #甲苯噻嗪 5.11 220.90>89.95 -22 1 0.002 83.69 NA 0.01 7.79 2.31 *#金霉素 5.95 479.10>443.85 -21 Ⅲ 0.02 58.06 0.1 0.1 8.84 14.37 强力霉素 6.56 445.10>427.90 -19 0.02 56.67 9.26 15.74 *#土霉素 5.21 461.10>425.95 -20 0.02 95.17 0.1 0.1 8.6 16 *#四环素 6.45 445.05>427.90 -20 0.02 51 0.1 0.1 6.38 18 *#阿苯达唑 7.67 266.20>233.90 -19 Ⅱ 0.005 64.47 0.1 0.1 7.76 7.51 #布帕伐醌 11.21 325.00>186.00 33 Ⅱ 0.01 37.63 NA 0.01 8.03 5.23 #布舍瑞林 6.51 620.50>592.20 -16 Ⅱ 0.005 63.32 NA 0.01 18.30 10.03 #卡前列素氨丁三醇 8.45 367.00>323.15 20 Ⅱ 0.01 66.90 NA 0.01 18.72 17.00 #氯前列醇钠 8.25 422.90>126.90 27 Ⅱ 0.01 71.02 NA 0.01 14.66 9.62 #乙胺嗪 1.60 200.00>99.95 -16 Ⅱ 0.01 99.04 NA 0.01 11.91 7.58 #伊维菌素 11.29 892.40>307.00 -22 0.005 101.80 NA 0.01 19.97 11.94 #马杜霉素 11.17 915.20>613.25 25 Ⅱ 0.005 52.80 NA 0.01 19.81 17.36 *#美洛昔康 7.99 352.20>115.05 -22 Ⅱ 0.01 71.11 0.015 0.01 6.26 8.19 #氯硝柳胺 10.31 324.70>171.00 26 0.005 58.84 NA 0.01 14.26 12.90 #帕苯达唑 7.53 247.90>216.00 -21 0.005 62.11 NA 0.01 8.02 7.02 #丙泊酚 1.57 179.00>101.00 -10 0.01 43.35 NA 0.01 5.37 3.65 #盐霉素 11.30 773.30>431.05 -52 Ⅱ 0.005 66.81 NA 0.01 14.54 16.03 #磺胺氯哒嗪 5.41 284.80>155.95 -15 0.005 61.55 NA 0.01 7.18 10.79 #磺胺喹恶啉 6.48 301.00>155.85 -16 0.005 69.10 NA 0.01 14.37 10.57 #安普霉素 4.10 540.00>217.00 -28 0.01 107.27 NA 0.01 9.57 6.81 *#二氢链霉素 4.03 584.00>263.05 -32 IV 0.01 103.65 0.2 0.02 6.09 4.76 *庆大霉素 4.14 464.00>322.10 -16 0.01 87.50 0.1 NA 2.79 11.65 *卡那霉素 4.06 485.00>163.00 -26 0.01 105.21 0.15 NA 2.99 4.05 *#新霉素 4.14 615.00>163.00 -36 IV 0.02 75.14 1.5 1.5 16.26 13.53 *#大观霉素 3.94 351.00>98.30 -20 IV 0.01 116.11 0.2 0.2 3.59 5.68 注：*为EU 管制化合物， #为FSSAI 管制化合物 在分析的所有化合物中，48种化合物的平均回收率在 70-120%之间，20种化合物的平均回收率在35-70% 之间。根据 SANTE 指 南，所有化合物回收率在 L OQ水平下的RSD%均 ≤20%，重现性良好(参见表 4)。该方法采用 L C -MS/MS 成功实现了40种化合物的 L OQ≤2 ug/k g 、14种化合物的 LOQ≤ 5 ug/kg、11种化合物的 LOQ≤10 ug/kg 和 5 种化合物的 LOQ≤ 20 ug/kg(参见表4)。图2显示了几种代表性化合物在其 LOQ水平下的色谱图。 图2 L OQ水平下的代表性色谱图和线性曲线 结论 使用 LC-MS/MS 开发了一种简单、灵敏、快速的方法定量 测定牛奶中的兽药残留。 基于 Shimadzu LC-MS/MS 开发的方法被证明具有高灵敏 度及较好的重现性，大多数化合物在痕量水平下显示出良好的 RSD，和 RSD (根据 SANTE 指南 REF2)。 该方法稳定、可靠，能够根据FSSAI 法规用于在实验室中 检测牛奶样品。 参考文献 1.M. Anastassiades ， S. J . Lehotay， D. Stajnbaher， F. J . Sche n c k ， Fast and Easy Mult i res i d u e Method Emp l oyi n g acetonit r i le Extract i on/Part it ioning and “Dispers i ve So l id-Phase Extraction” for the Determinat i on of Pest i cide Residues i n Produce， J . AOAC Int.， 86；412-431，2003. 2.Gu i d a nce document o n ana l yt i cal q u ality control and method validation procedu r es for pest i c i de r esidue s a n d analysis i n f ood a n d feed . SANTE/12682/2019. 岛津企业管理(中国)有限公司 岛津(香港)有限公司 免责声明： *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 http：//www.shimadzu.com.cn 如有变动，恕不另行通知。