LC-MS/MS法测定化妆品中新康唑等8种物质

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱串联质谱联用仪测定化妆品中新康唑等8种硝基咪唑类抗生素含量的方法。方法参照国家药品监督管理局发布的化妆品补充检验方法2022年第77号公告《化妆品中新康唑等8种组分的测定》。该方法在12 min内完成测试。方法采用外标法定量，8种物质在2~500 ng/mL浓度范围内呈良好线性，检出限为0.05~0.6 ng/mL。样品经过乙腈提取后上机分析。加标结果显示8种物质在0.5、2.5、10 mg/kg 3个浓度水平下，平均回收率为85.7%~108.1%，相对标准偏差为1.51%~6.46%。本文所建立的方法快速、有效，可应对化妆品中新康唑等8种物质的日常监测工作。SSL-CA23-109Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-764 LC-MS/MS 法测定化妆品中新康唑等8种物质 LCMSMS-764 摘要：本文建立了使用岛津三重四极杆液质联用仪测定化妆品中新康唑等8种硝基咪唑类抗生素的方法。方 法参照国家药监局2022年第77号公告《化妆品中新康唑等8种组分 的 测定》。本方法采用外标法定量，在 12 min 内完成测试。方法准确度高，重复性好。该方法快速、有效，可应对 化 妆品中8种硝基咪唑类抗生 素 的风险监测需求。 关键词：超高效液相色谱 三重四极杆质谱 化妆品 硝基咪唑类抗生 素 技术特点： 小满足国家药监局化妆品补充检验方法《化妆品中新康唑等8种组分的测定》要求； 必该方法可有效应对化妆 品 风险监控项目。 新康唑等8种物质属于硝基咪唑类抗生素，其可抑 制真菌麦甾醇生物合成，并改变细胞膜其他脂类化合物 的组成，可用于去屑、杀菌和调节皮肤油脂。然而 ，人 体长期接触含此类抗生素的化妆品，易引起接触性皮炎、抗生素过敏等症状，易产生耐药性，药物残留还可能导 致过敏反应。因此，该8种组分主要应用于医学领域，在化妆品领域属于违禁成分。 2022年9月，国 家药监局发布2022年第77号公 告《化妆品中新康唑等8种组分的测定》。该方法采用 液质联用的方法对化妆品 中 新康唑等8种组分进行检测。 本文参照国家药 监 局发布的方法，建立 了 LC -MS/MS 法 测 定化妆品中新康唑等8种组分。该方法快速、准确，可以很好地应对化妆品中新康唑等抗生素非法添 加的快速筛查和准确定量。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津超高效液相色谱仪 LC-40 与 LCMS-8050 联用系统，具体配置为： 系统控制器：：CBM-40脱 气 机儿：DGU-405输液 泵 LC -40B X3自动进样器 ：SIL -40C X3柱温 箱：：(CTO-40C 质谱检测器：LCMS -8050 色谱 工 作站： LabSolutions Ver . 5.114 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：ACE Excel 3 C18-AR ((150 mm x 4.6mml.D.，3 um) 流动相目： A相-0.1%甲酸水溶液；B相 -乙腈 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓 度 为50%，洗脱程序见表1 0.5 mL/min 进样量 量： 2uL 流速 柱温 40℃RO清 洗 液：50%甲醇 表1 梯 度 洗脱程 序 Time(min) Module Command Value 3.00 泵 B.Conc 50 5.00 泵 B.Conc 70 6.00 泵 B.Conc 95 7.80 泵 B.Conc 95 8.00 泵 B.Conc 50 12.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器：LCMS-8050离子化模式：ES+接口电压：11.0kV 雾 化 气：氮气 3.0 L/min 干 燥 气： 氮气 10.0 L/min碰 撞 气：氩气 接口温度：4400°℃DL 温 度：250°℃扫描模式：多多反应监测 ((MRM)加热模块温 度 ：400°℃ MRM 参数： 见表2 表2 化合物 信 息及 MRM 优化参数 序号 化合物 英文名称 CAS 号 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 1 羟基甲硝唑 Hydroxymetronidazole 4812-40-2 188.2 123.2* 126.2 -11 -12 -15 -16 -22 -23 140.2* -10 -13 -30 2 洛硝哒唑 Ronidazole 7681-76-7 201.2 55.2 -11 -22 -22 3 苯硝咪唑 5-Nitrobenzimidazole 94-52-0 164.2 118.2* -10 -22 -20 91.1 -10 -39 -15 4 替硝唑 Tinidazole 19387-91-8 248.2 121.2* -13 -17 -20 128.2 -13 -22 -13 5 奥硝唑 Ornidazole 16773-42-5 220.2 82.1* -12 -30 -16 128.2 -12 -15 -13 6 氯甲硝咪唑 5-Chloro-1-meth- 4897-25-0 162.1 145.1* -19 -16 -26 vl-4-nitroimidazole 116.1 -19 -16 -11 109.2* -22 -25 -21 7 异丙硝唑 Ipronidazole 14885-29-1 170.2 124.2 -22 -20 -20 8 新康唑 Elubiol 67914-69-6 561.0 250.0* -28 -35 -26 515.0 -28 -31 -26 注：*表 示 定 量 离 子 1.3标准品的配制 称取标样 10 mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解，得到1mg/mL标准储备溶液。准确移取各 标 准储 备液 100 uL 于 10mL容量瓶中，用50%乙腈定容，得到浓度为 10 ug/mL的混合标准中间溶液。 基质空白溶液：称取试样0.5 g，按照1.4方法处理，得到基质空白溶液。 基质标准中间液：量取1mL混合标准中间溶液于 10mL容量瓶中，用基质空白溶液定容至刻度。得到1ug/mL基质标准中间液。 校准曲线配制：以基质空白溶液为溶剂，将基质标准中间液逐级稀释至浓度为2、10、50、100、200、500ng/mL 的 标准点，上机分析。 1.4样品前处理方法 称取样品0.5g， 置于25mL 具塞离心管 中，加入饱和氯化钠溶液1mL， 涡旋振荡1min，分散均匀后加入 乙腈20 mL，涡 旋 30s，超声提取30 min， 加入乙腈定容至刻度，10000 r/min 的转速离心3 min，取上 清 液经0.22um 微孔滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液备用(样品溶液可根据实际浓度进行适当稀释)。 ■结果与讨论 2.1化合物色谱图 图1新康唑等8种化 合 物总离子流图(100 ng/mL，化 合 物序号同 表 2) 2.2线性范围 按照1.3项下配制方法，配制校准曲线。以化合物浓度为横坐 标 ，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，权 重设置为 1/C，8种化合物在指定浓度内线性良好，相关系数大于 0.999。以校准曲线浓度最低点使用3倍信噪 比的方式计算检出限，得出8种化合物的检出限为 0.05~0.6 ng/mL。 图2新康唑等8种化合物校准曲线(部分) 表3新康唑等8种化合物校准曲线参数 序号 化合物 线性范围(ng/mL) 相关系数r 加权系数 准确度(%) 检出限很(ng/mL) 1 羟基甲硝唑 2~500 0.9993 1/C 91~104 0.05 2 洛硝哒唑 2~500 0.9994 1/C 91~107 0.05 3 苯硝咪唑 2~500 0.9998 1/C 96~103 0.3 4 替硝唑 2~500 0.9992 1/C 96~101 0.2 5 奥硝唑 2~500 0.9999 1/C 97~101 0.2 6 氯甲硝咪唑 2~500 0.9996 1/C 90~105 0.6 7 异丙硝唑 2~500 0.9998 1/C 94~107 0.05 8 新康唑 2~500 0.9997 1/C 91~102 0.05 2.3重复性 分别对 10 ng/mL 和 200 ng/mL标准溶液连续分析6次，计算重复性 。结果见表4.8种化合物的保留时间 RSD 为 0.01~0.19%，峰面积 RSD 为 0.61%~4.76%，重复性良好。 表4 新 康 唑等8种化 合 物重复性结果 ((n =6) 序号 化合物 测试浓度(ng/mL) 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% 1 羟基甲硝唑 10 0.19 4.76 200 0.11 2.36 2 洛硝哒唑 10 0.03 2.96 200 0.00 1.22 3 苯硝咪唑 10 0.07 2.86 200 0.03 1.46 4 替硝唑 10 0.04 4.73 200 0.01 0.61 5 奥硝唑 10 0.06 4.28 200 0.02 1.13 6 氯苯硝咪唑 10 0.07 2.86 200 0.03 1.46 7 异丙硝唑 10 0.08 1.68 200 0.01 2.35 8 新康唑 10 0.05 3.91 200 0.02 1.36 2.4方法准确性和精密 度 取某化妆品乳液，按照1.4前处理方式进行处理，样品中未检出新康唑等8种物质。向 样品中添加浓度为 0.5、2.5、10 mg/kg 3个水平的加标量，每个水平重复3次，进行加标回收率和精密度试验。表5为实验结果，新 康唑等8种物质的 平 均回收率为 85.7%~108.1%，相对标准 偏 差为1.51%~6.46%。 R T (min) 图3 实际样品和加标回收样品(加标浓度： 2.5mg/kg) 总离子流图 表5 加标回 收和精 密度结果 ((n =3) 序号 化合物 样品浓度(mg/kg) 添加浓度(mg/kg) 平均回收率 (%) 相对标准偏差 RSD% 0.5 92.6 6.46 1 羟基甲硝唑 N.D. 2.5 90.7 3.37 10 95.3 1.75 0.5 87.6 2.83 2 洛硝哒唑 N.D. 2.5 98.1 2.05 10 104.9 1.51 0.5 95.2 5.21 3 苯硝咪唑 N.D. 2.5 103.7 4.31 10 105.4 2.12 0.5 90.0 2.73 4 替硝唑 N.D. 2.5 98.2 2.06 10 107.2 1.74 0.5 98.0 2.67 5 奥硝唑 N.D. 2.5 103.6 1.71 10 108.1 1.99 0.5 86.0 4.90 6 氯甲硝咪唑 N.D. 2.5 93.3 3.33 10 103.7 2.57 0.5 85.7 1.25 7 异丙硝唑 N.D. 2.5 99.5 1.82 10 107.2 1.67 0.5 105.5 5.85 8 新康唑 N.D. 2.5 103.5 3.31 10 104.3 4.49 注： N.D.表示未检 出 。 ■结论 本文建立 了 一种使用岛津超高效液相色谱串联质 谱 联用仪测定化妆品中新康唑等8种 硝 基 咪 唑类抗生素含量的 方法。方法参照国家药品监督管理局发布的化妆品补充检验方法2022年第77号公告《化妆品中新康唑等8种组分 的测定》。该方法在 12 min 内完成测试。方法采用外标法定量，8种物质在 2~500 ng/mL 浓度范围内呈良好线性，检出限为 0.05~0.6 ng/mL。样品经过乙腈提取后上机分析 。加标结果显示8种物质在0.5、2.5、10 mg/kg 3个浓度 水平 下 ，平均回收率为 85.7%~108.1%，相对标准偏差为1.51%~6.46%。本文所建立的方法快速、有效，可应对化 妆品中新康唑等8种物质 的 日 常监 测工作。