动物性食品中环丙氨嗪的提取与检测

实验结果及讨论环丙氨嗪，又名灭蝇胺，是一种含氮杂环类亲水性化合物，前处理可以通过强阳离子交换的固相萃取柱（SelectCore MCX）结合后，用氨水甲醇洗脱出来，再用HILIC体系进行分析测定。ChromCore HILIC-CM环丙氨嗪专用柱是基于亲水作用（HILIC）和离子交换（IEX）混合机制对环丙氨嗪进行色谱保留。我们注意到在国标方法中流动相乙酸铵描述浓度（25 mM）和实际操作所对应的浓度（2.5 mM）不一致，因此对两种缓冲盐浓度都进行了尝试。实验结果表明：流动相盐浓度对环丙氨嗪的保留和分离有着显著的影响；环丙氨嗪保留时间随着流动相中乙酸铵浓度降低而升高，符合阳离子交换保留机理特征。羊肉和鸡肉样品加标测试结果表明：在使用25 mM乙酸铵的流动相时，环丙氨嗪保留时间适中（k=6.1），可以有效定量，但距一个基质峰相近；而在2.5 mM乙酸铵流动相条件下，环丙氨嗪保留时间延后（k=7.8），可以完全排除基质干扰。HILIC体系由于对溶剂效应较为敏感，因此建议样品稀释溶剂和流动相要保持一致，另外有部分仪器的洗针液也需要设置含水量较少的溶剂体系，否则容易出现倒峰而影响积分。动物性食品中环丙氨嗪的提取与检测 背景 环丙氨嗪(别名灭蝇胺)，是 一 种选择性昆虫生长调节剂，可诱使双翅目幼虫和蛹在形态上发生畸变，使成虫羽化不全。2002年我国农业部批准环丙氨嗪为三类新兽药，尽管环丙氨嗪毒性较小，但研究表明环 丙氨嗪在动物体内的主要代谢产物是具备致癌性的三聚氰胺，因此农业部235号公告规定了动物性食品中 环丙氨嗪的最高残留 量 ，同时国标 GB 31658.12-2021也规定了动物性食品中环丙氨嗪的提取与检测方法。 环丙氨嗪结构式 2023年国家食品安全监督抽检实施细则中增加对于羊肉、鸡肉等畜禽肉及副产品中环丙氨嗪的检测。针对这一热点需求，纳谱分析在国标方法的指导原则框架下对环丙氨嗪检测的整体解决方案进行了探索性 研究，在此与色谱同行分享，欢迎交流探讨。 适用范围 本方法参照 GB 31658.12-2021食品安全国家标准动物性食品中环丙氨嗪残留量的测定高效液相色谱法，适用于羊和禽肌肉、脂肪、肝脏及羊肾脏组织中环丙氨嗪的提取与检测。 实验步骤 1、溶液配制 国标描述浓度： 25 mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵1.9 g， 加水950g使溶解，用乙酸调 pH至5.0， 再加50g水；国标配制方法浓度： 2.5 mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵 0.19 g， 加水950g使溶解，用乙酸调 pH至5.0，再加50g水； 1%三氯乙酸溶液：取三氯乙酸1g， 用水溶解并稀释至100mL； 提取液：取1%三 氯乙酸溶液 15mL， 用乙腈稀释至100mL； 0.1 mol/L 盐酸溶液：取盐酸9mL，用水稀释至1000mL； 5%氨水甲醇溶液：取氨水5mL，用甲醇稀释至100mL； 流动相：称取25mmol/L 乙酸铵溶液 40g， 乙腈758.4g， 混合均匀。 2、样品制备 取试料 5 g±0.02g，于50mL离心管，加提取液15 mL， 高速均质使均匀分散，以5000 rpm 离心 5 min，取上清液于 100 mL分液漏斗中，残渣加提取液10 mL， 重复提取1次，合并上清液，加正已烷30mL，振 摇2 min， 静置使分层。收集下层液于 100 mL鸡心瓶中，50℃水浴旋转蒸发至1mL(需控制真空度防止 爆沸)，转至10mL 刻度离心管中，用提取液淋洗鸡心瓶2次，每次2mL，合并提取液，以 10000 rpm 离 心5 min， 取上清液，备用。 3、样品前处理 SelectCore MCX 固相萃取柱60 mg/3 mL： (1)活化：依次用甲醇3mL和水3mL活化； (2)上样：取上清液过柱，控制流速 1 mL/min； (3)淋洗：：依次用甲醇3mL、0.1 mol/L 盐酸溶液3mL、水3mL和甲醇3mL淋洗，抽干； (4)洗脱：用5%氨水甲醇溶液 5mL洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干，用1.0 mL 流动相复溶，涡旋 30s，滤膜过滤，供高效液相色谱测定。 4、高效液相色谱法测定 实验条件： Column： ChromCore HILIC-CM 环丙氨嗪专用柱 3um Dimension： 2.1×150 mm Mobile Phase： 96/4 v/v 乙腈/25 mM 乙酸铵， pH5.0 Flow rate： 0.3 mL/min Temperature： 30°℃ Injection： 20 uL Detection： UV 214 nm 实验谱图 图1环丙氨嗪标准品、羊肉样品、羊肉样品加标对比图 图2环丙氨嗪标准品、鸡肉样品、鸡肉样品加标对比图 样品 加标量 回收率 羊肉 50 ug/kg 82.14% 鸡肉 50 ug/kg 85.19% 实验结果及讨论 环丙氨嗪，又名灭蝇胺，是一种含氮杂环类亲水性化合物，前处理可以通过强阳离子交换的固相萃取 柱 (SelectCore MCX)结合后，用氨水甲醇洗脱出来，再用 HILIC 体系进行分析测定。 ChromCore HILIC-CM 环丙氨嗪专用柱是基于亲水作用 (HILIC)和离子交换(IEX) 混合机制对环丙 氨嗪进行色谱保留。我们注意到在国标方法中流动相乙酸铵描述浓度(25mM)和实际操作所对应的浓度 (2.5mM)不 一 致，因此对两种缓冲盐浓度都进行了尝试。实验结果表明：流动相盐浓度对环丙氨嗪的保 留和分离有着显著的影响；环丙氨嗪保留时间随着流动相中乙酸铵浓度降低而升高，符合阳离子交换保留 机理特征。羊肉和鸡肉样品加标测试结果表明：在使用25mM 乙酸铵的流动相时，环丙氨嗪保留时间适中 (k-6.1)，可以有效定量，但距一个基质峰相近；而在2.5mM乙酸铵流动相条件下，环丙氨嗪保留时间 延后(k=7.8)，可以完全排除基质干扰。 HILIC 体系由于对溶剂效应较为敏感，因此建议样品稀释溶剂和流动相要保持 一 致，另外有部分仪器 的洗针液也需要设置含水量较少的溶剂体系，否则容易出现倒峰而影响积分。 结论 由此可见，样品经 SelectCore MCX 固相萃取柱净化后，在ChromCore HILIC-CM 环丙氨嗪专用柱可以 实现样品基质杂质不干扰环丙氨嗪的检测，加标回收率满足检测要求。 与此同时，考虑到亲水作用分离模式的特性(受基质影响大)、实际样品的复杂性以及不同生产厂家 同类色谱柱之间的差异性，为了提高方法的易操作性和可重复性，我们建议以下几点： 1.在固定流动相有机溶剂含量的前提下，乙酸铵的浓度在一定的范围内可以调整(排除基质干扰) 2. 在固定流动相有机溶剂含量的前提下，乙酸铵的 pH 在一定的范围内可以调整(排除基质干扰) 3. 通常来讲，2.1mm 内径色谱柱对操作人员和液相色谱仪的要求较高，因此多用于质谱检测。由于 此方法检测器是紫外(UV)，不涉及到质谱检测，所以 2.1 mm 内径色谱柱不是必要的。相比之下，4.6 mm 或 3.0 mm 内径色谱柱更适用在常规液相色谱仪上实现该检测方法。 以上是纳谱分析在环丙氨嗪的检测方面的初步结果，同时我们将持续从色谱技术方面对应用进行系统 性研究，并用不同样品考察该方法的实用性和耐受性。 订购信息 产品描述 规格 货号 ChromCore HILIC-CM 环丙氨嗪专用柱 3pm，2.1×150mm S018-030012-02115S SelectCore MCX 固相萃取柱 60mg/3mL MCX060-030060-1