使用氨基酸分析仪检测人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中的19种氨基酸（锂型）

本文使用岛津氨基酸分析仪建立了人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中19种氨基酸的检测方法（锂型）。该方法准确可靠，精密度良好，满足YY/T 1695-2020《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法》第一法氨基酸分析仪法（仲裁法）的要求，可用于此类医疗器械相关的检测。岛津SHIMADZUSSL-CA22-574Excellence in Science 岛津SHIMADZUExcellence in ScienceLC-362 使用氨基酸分析仪检测人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中的19种氨基酸(锂型) LC-362 摘要：本文使用岛津氨基酸分析仪建立了人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中19种氨基酸的检测方法(锂型)。采用外标法定量，19种氨基酸线性良好，相关系数均大于 0.9997。精密度实验中，保留时间的RSD 在 0.01%~0.33%之间，峰面积的 RSD 在0.69%~3.70%之间。各组分分离度满足 YY/T 1695-2020《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法》第一法氨基酸分析仪法(仲裁法)的要求，，可为相关从业人员提供参考。 关键词：氨基酸分析仪 锂型 YY/T 1695-2020 技术特点： 心使用柠檬酸锂缓冲液，建立了锂型离子交换色谱柱的氨基酸分析方法。 心分离度高，满足 YY/T 1695-2020 标准要求。 YY/T 1695-2020《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法》于2021年4月1日实施。标准规定了用氨基酸分析仪法、高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法、高效液相色谱柱前衍生法检测人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸成分，其中，第一法一氨基酸分析仪法为仲裁方法。 标准涉及19种氨基酸，包括甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、酪氨酸((Tyr)、组氨酸((His)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、异 实验部分 1.1仪器 岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA，配置信息如下： 系统控制器：CBM-20A 自动进样器：SIL-16 泵：：LC-16×3 输液柱温箱：CTO-16L 化学反应箱：(CRB-40检测 器：：SPD-16 色谱工作站： Labsolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 色谱柱：：Shim-pack Amino-Li (100 mm×6.0 mml.D.， 5um， SGLC， P/N： 228-18837-92)捕氨洗脱 柱：Shim-pack ISC-30 /S0504 Li (50 mm×4.0 mmI.D.， SGLC， P/N： 228-00821-91) 液：：锂型氨基酸分析流动相试剂包 (SGLC， P/N： 228-21195-95) 衍生试剂：茚三酮衍生试剂 (SGLC， P/N： AW208-09626) 流速：0.6 mL/min 衍生液流速：0.2 mL/min 柱 温：39℃ 衍生反应温度： 130℃ 进样体积：20pL 检测波长：570nm/440nm 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度0%，洗脱程序见表1 SV(PumpA)：A泵溶剂切换阀，初始值A 表1 梯度洗脱程序 时间((min) 单元 处理命令 值 22.00 泵 B.Conc 0 24.00 泵 B.Conc 1 28.50 泵 B.Conc 1 28.51 泵 B.Conc 4 28.51 泵 B.Curve 4 56.00 泵 B.Conc 6 56.01 泵 B.Conc 9 69.00 泵 B.Conc 9 69.00 泵 B.Curve -2 86.00 泵 B.Conc 29 86.01 泵 B.Conc 34 86.01 泵 B.Curve -2 108.00 泵 B.Conc 51 108.01 泵 B.Conc 61 111.00 泵 B.Conc 68 111.01 泵 B.Conc 100 133.00 泵 SV(Pump A) B 143.70 泵 B.Conc 100 143.71 泵 B.Conc 0 147.70 泵 SV(PumpA) A 163.00 控制器 Stop 1.3对照品溶液配制 牛磺酸、色氨酸对照品储备液：取牛磺酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成牛磺酸对照品储备液，浓度为2.5 mmol/L。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴 0.1 mol/L 氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度，浓度为1.25 mmol/L。 17种氨基酸对照品储备液：0.1mol/L 盐酸溶液中的17种氨基酸，其中丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸浓度各 2.5 mmol/L，胱氨酸浓度为 1.25 mmol/L。 混合氨基酸对照品系列溶液：取以上三种氨基酸对照品储备液各适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，其中牛磺酸、天冬氨酸、丝氨酸、、甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸浓度各在2.9~1500umol/L范围，苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸浓度各在5.9~1500 umol/L范围，精氨酸 11.7~1500 umol/L，胱氨酸1.5~750 umol/L， 色氨酸5.9~750 umol/L， 4℃冰箱可保存一周。 1.4试样制备 取培养液样品 0.5 mL， 加入0.5 mL4%磺基水杨酸，混匀后9500g离心10 min， 取0.5 mL上清液加入0.5mL水，混匀后进样检测。 ■结果与讨论 2.1色谱图 对照品溶液色谱图见图1，除脯氨酸(Pro) 采用 440 nm检测，其余18种氨基酸均采用570nm。结果显示，19种氨基酸分离度均满足标准要求 (YY/T 1695-2020中 4.8.1分离度各氨基酸分离度≥85%)) 图1 对照品溶液色谱图(胱氨酸与色氨酸浓度为 23.4 umol/L， 其他46.9 umol/L) 2.2校准曲线 按照1.2项下分析条件，对混合氨基酸对照品系列溶液进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法拟合校准曲线。各氨基酸线性关系良好，相关系数均大于0.9997，校准曲线信息如表2所示。 表219种氨基酸校准曲线 序号 氨基酸名称 简称 校准曲线 线性范围 (umol/L) 相关系数r 准确度(%) 1 牛磺酸 Tau Y=(7703.55)X+(-1456.34) 2.9~1500 0.9999 98.8~100.9 2 天冬氨酸 Asp Y=(17465.5)X+(-5876.98) 2.9~1500 0.9999 97.9~103.2 3 苏氨酸 Thr Y=(19439.6)X+(-1233.54) 5.9~1500 0.9999 98.9~101.0 4 丝氨酸 Ser Y=(18879.4)X+(-7534.74) 2.9~1500 0.9999 93.6~106.5 5 谷氨酸 Glu Y=(20198.6)X+(9900.39) 5.9~1500 0.9999 94.5~103.7 6 脯氨酸 Pro Y=(5295.27)X+(2252.15) 5.9~1500 0.9997 93.6~104.7 7 甘氨酸 Gly Y=(25403.6)X+(2275.98) 2.9~1500 0.9999 95.5~103.4 8 丙氨酸 Ala Y=(17104.9)X+(6535.56) 2.9~1500 0.9999 90.7~109.2 9 胱氨酸 Cys Y=(25515.0)X+(-8381.47) 1.5~750 0.9999 97.9~102.3 10 缬氨酸 Val Y=(17113.2)X+(-3180.87) 5.9~1500 0.9999 99.0~101.3 11 甲硫氨酸 Met Y=(22915.3)X+(-13819.0) 2.9~1500 0.9999 97.1~102.8 12 异亮氨酸 ILE Y=(17673.9)X+(4086.97) 5.9~1500 0.9999 92.4~103.5 13 亮氨酸 Leu Y=(22275.3)X+(6074.37) 5.9~1500 0.9999 96.9~101.9 14 酪氨酸 Tyr Y=(22392.8)X+(2915.58) 2.9~1500 0.9999 97.9~101.8 15 苯丙氨酸 Phe Y=(21736.4)X+(4052.25) 2.9~1500 0.9999 94.7~107.4 16 组氨酸 His Y=(24680.5)X+(2209.05) 2.9~1500 0.9999 97.5~101.9 17 赖氨酸 LYS Y=(14623.2)X+(-11056.6) 2.9~1500 0.9998 95.2~110.7 18 色氨酸 Irp Y=(18669.0)X+(-175.793) 5.9~750 0.9999 93.3~105.3 19 精氨酸 Arg Y=(8365.76)X+(-18361.5) 11.7~1500 0.9998 97.5~102.6 2.3精密度 对 46.9 umol/L (胱氨酸和色氨酸为 23.4 umol/L)的的混混合合氨氨基基酸对照品溶液连续测定6次，考察仪器精密度，所得结果见表3。结果显示，19种氨基酸保留时间的 RSD 在0.01%~0.33%之间，峰面积的 RSD 在 0.69%~3.70%之间，仪器精密度良好。 表3 保留时间和峰面积精密度结果(n=6) 序号 氨基酸名称 保留时间 RSD(%) 峰面积 RSD(%) 1 Tau 0.04 1.45 2 Asp 0.33 1.58 3 Thr 0.20 1.70 4 Ser 0.15 1.14 5 Glu 0.09 0.77 6 Pro 0.03 3.70 7 Gly 0.05 0.81 8 Ala 0.05 1.09 9 Cys 0.02 1.21 10 Val 0.03 2.13 11 Met 0.02 1.09 12 ILE 0.04 2.03 13 Leu 0.01 1.18 14 Tyr 0.02 0.69 15 Phe 0.01 0.91 16 His 0.01 0.71 17 Lys 0.01 1.26 18 Trp 0.07 2.19 19 Arg 0.03 3.31 2.4样品测定及加标回收率 取培养液样品按照1.3节处理，进样测定。在样品中加入低、高两浓度19种氨基酸混合对照品溶液，进样测定，计算加标回收率。 样品浓度、添加浓度及加标回收率结果如表4所示，19种氨基酸的加标回收率在94.2~114.0%之间，表明该方法准确度良好。 表4样品测定及加标回收率结果 序号 氨基酸名称 样品浓度 (umol/L) 添加浓度 (umol/L) 加标浓度(umol/L) 回收率(%) RSD(%) 1 Tau N.D. 46.9 50.30 107.3 0.59 375.0 400.02 106.7 1.08 2 Asp N.D. 46.9 52.28 111.5 0.68 375.0 411.07 109.6 1.04 3 Thr 10.55 46.9 61.81 109.4 1.49 375.0 420.78 109.4 0.79 4 Ser 11.37 46.9 60.51 104.8 1.03 375.0 417.92 108.4 1.10 5 Glu 4.90 46.9 55.44 107.8 1.30 375.0 416.59 109.8 1.44 6 Pro N.D. 46.9 46.90 100.1 0.92 375.0 364.20 97.1 1.19 7 46.9 60.90 103.9 0.42 Gly 12.21 375.0 409.99 106.1 0.86 8 Ala 47.31 46.9 91.47 94.2 1.10 375.0 427.86 101.5 0.84 23.4 25.09 98.6 1.25 9 Cys 1.98 187.5 194.20 102.5 1.13 10 Val 20.88 46.9 70.84 106.6 1.16 375.0 426.08 108.0 1.43 11 50.73 108.2 0.18 Met N.D. 46.9 388.35 103.6 1.05 12 46.9 53.37 113.8 1.69 ILE N.D. 375.0 407.39 108.6 0.86 13 46.9 73.66 106.9 1.07 Leu 23.54 375.0 433.08 109.2 0.87 46.9 57.23 110.2 0.80 14 Tyr 5.56 375.0 418.47 110.1 0.90 15 Phe 9.46 46.9 61.24 110.5 0.97 375.0 421.51 109.9 0.90 16 46.9 58.27 114.0 0.62 His 4.84 375.0 431.97 113.9 0.99 17 19.32 46.9 66.31 100.2 0.62 LyS 375.0 394.11 100.0 1.74 23.4 24.94 106.4 0.65 18 Trp N.D. 187.5 211.42 112.8 1.73 19 Arg N.D. 46.9 50.27 107.2 0.80 375.0 388.46 103.6 0.91 N.D.： 未检出 结论 本文使用岛津氨基酸分析仪建立了人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中19种氨基酸的检测方法(锂型)。该方法准确可靠，精密度良好，满足 YY/T 1695-2020《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法》第一法氨基酸分析仪法(仲裁法)的要求，可用于此类医疗器械相关的检测。