核酸药物中热稳定性检测方案(紫外分光光度计)

Application No.A618News岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司http：//www.shimadzu.com.cn第一版发行行：2020年4月400-650-0439 光谱分析 使用Tm分析系统(TMSPCTM-8)分析核酸药物的热稳定性 近年来，以核酸药物为首的功能性核酸备受关注。在研发和评价这种功能性核酸时，热稳定性是很重要的指标，它是控制结构和功能的因素。此外，热稳定性分析在基于核酸杂交的方法(如PCR和DNA微阵列)中也是必不可少的。 本文使用紫外可见分光光度计 UV-1900i 和 Tm分析系统(TMSPC-8)进行了核酸的热稳定性分析(Tm分析)。通过使用本系统，可以很容易地计算出核酸的Tm 值。 A.Goto 核酸的热性质 核酸(DNA、RNA)具有双链螺旋结构，但当温度升高时，氢键断裂，双链逐渐解体，形成单链结构。这种现象称为核酸的“溶解”，将双链和单链所占比例相等的温度定义为解链温度(MeltingTemperature；Tm)。 Tm 值是表征核酸热稳定性的指标，Tm取决于碱基序列、核酸浓度、错配(非互补性碱基配对)等。 核酸在260 nm 附近有一个紫外吸收峰，吸收值在解链过程中增加(图1)。Tm分析系统测定该吸光度变化，以确定Tm值。 图1核酸的TM曲线 Tm分析系统(TMSPC-8) 图2为 UV-1900i 和Tm分析系统(TMSPC-8)图片。本系统由8列电子冷却池支架、专用8列微量比色池(光程10mm、1mm)、温度控制器和Tm 分析软件构成，最多可同时测定8个样品。 图2UV-1900i 和 Tm 分析系统(TMSPC-8) 通过 TMSPC-8 进行核酸的Tm分析 本文使用了一种M13-25mer核酸作为样品。 首先进行了样品溶液脱气的预处理(如果溶液中空气，在高温下会产生气泡，无法准确测定)。此外，退火是确保正义链和反义链双链结构完全形成必需的条件。这里退火条件是温度保持在95℃10分钟以上，然后以2℃ /min 的速度降温。 专用8列微量比色池的光程有 10mm 和1mm两种，可根据样品的吸光度(浓度)来选择。这里配置的样品浓度，使用光程为 10 mm的比色池(图3)，在260 nm 处的吸光度为0.5~1。按照表1的测定条件进行了测定。 图3专用8列微量比色池(光程10 mm) 表1测定条件 分析仪器 UV-1900i、Tm分析系统TMSPC-8 ◆测定参数 测定波长 ：260nm/320nm*1 狭缝宽 ：1.0nm 池空白校正 ：启用 ◆温度参数 起始温度 ：15°C 起始保留时间 ：1800秒 升温速率 ：1.0℃/分 等待测定 ：45秒 测定间隔 ：0.5℃ 结束温度 ： 95C *1320nm 不是核酸吸收波长，作为基线减去此处的吸光度。可减少不同比色池的偏差，获得偏差较小的数据。 图4显示了通过Tm软件测定获得的TM曲线(绘制260nm 处的吸光度对温度曲线)显示了升温时和降温时的结果。从图4可以看出，吸光度随温度升高而增大。此外，溶解曲线按照温度升序排列可分为三个区域，即前跃迁区域、跃迁区域和后跃迁区域。前跃迁区域、后跃迁区域中，双链和单链分别过量存在。 图4样品的 TM 曲线 Tm 值通过中线法和微分法两种计算方法进行了计算。表2结果为通过两种分析所得到的Tm 值的结果。升温时和降温时得到了等效的结果。 表2Tm 分析的结果 计算方法 Tm 值(℃) 升温 降温 中线法 63.58 63.56 微分法 63.68 64.10 TMSPC 为岛津制作所株式会社在日本及其他国家的商标。 在中线法中，对前跃迁区域、后跃迁区域中选择的每个区间分别绘制切线，并计算两条切线的中线与吸光度曲线的交点作为Tm值(解链温度)。如图5所示，任意设置前跃迁区域和后跃迁区域，得出 Tm 值。 另一方面，在微分法中，对设定区间内的各设定点数进行一阶微分运算，计算显示其最大值的位置作为Tm 值(解链温度)。如图6所示，任意设置判定区域，得出Tm 值。 图5基于中线法的分析 图6基于微分法的分析 结论 本文使用紫紫可见分光光度计 UV-1900i和Tm分析系统(TMSPC-8)进行了核酸的热稳定性分析(Tm分析)。利用本系统，通过测定260 nm 处吸光度随温度升高的变化来计算了Tm 值。此外，使用专用8列微量比色池可以同时最多测定8个样品。 根据测定得到的TM曲线，通过中线法和微分法两种计算方法计算出Tm 值。 ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) 本文使用紫外可见分光光度计UV-1900i和Tm分析系统（TMSPC-8）进行了核酸的热稳定性分析（Tm分析）。利用本系统，通过测定260 nm处吸光度随温度升高的变化来计算了Tm值。此外，使用专用8列微量比色池可以同时最多测定8个样品。根据测定得到的TM曲线，通过中线法和微分法两种计算方法计算出Tm值。