疫苗中卡那霉素残留量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-094Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-636 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMSMS检测疫苗中卡那霉素残留 LCMSMS-636 摘要：本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪检测疫苗中卡那霉素抗生素残留的方法。样品经乙腈沉淀蛋白，离心滤过后上机分析。采用外标法定量，在0.5~100ng/mL范围内，相关系数大于 0.997。 LOQ基质标液0.5 ng/mL连续6次进样保留时间 RSD% 小于0.4%，峰面积的 RSD 为 5.06%，仪器精密度良好。三个浓度样品加标回收率在90.10~101.50%之间，每个浓度平行处理三次，测试结果的 RSD 在 0.65~2.38%之间；该方法稳定可靠，可为疫苗及生物制品中卡那霉素抗生素残留测定提供参考。 关键词：卡那霉素残留 疫苗 三重四极杆液质联用仪 卡那霉素是一种常见的氨基糖苷类抗生素，主要通过与细菌核糖体30S亚单位结合，进而抑制细菌蛋白质合成，达到杀菌和抑菌的作用。目前传统的细胞培养中常用的一种高效和高性价比的抗生素，用于细胞生产过程中为了预防潜在的细菌污染的风险。但是抗生素的加入，导致后期生产纯化过程中无法彻底去除，需要严格进行含量控制，保证生物制品产品质量的安全性。 对于生物制品中的卡那霉素检测，目前常用的方法为酶联免疫吸附试验(ELISA) 方法，该方法设备简 单，成本低，易于操作，但是由于细胞培养的培养基中成分复杂，含有的蛋白和脂类等一些内源性物质，常会对 ELISA 法的结果造成干扰，进而影响检测灵敏度和专一性。目前需要一种普适用于生物制品中卡那霉素抗生素的快速检测方法。 本文建立了一种采用三重四极杆液质联用仪检测卡那霉素的残留量的分析方法。该方法前处理简单、专一性强、分析速度快、灵敏度高，可供相关分析检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津超高效液相色谱仪LC-40 与三重四极杆质谱仪LCMS-8045 联用系统。 具体配置为： 系统控制器： SCL-40脱气机： DGU-405输液泵： LC-40BX3×2自动进样器：SIL-40CX3柱温箱：CTO-40S质谱仪：LCMS-8045 色谱工作站： LabSolutions Ver.5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST Amide 150 mm x2.1 mm l.D.， 3.0 um； P/N： 227-30818-06；岛津(上海)实验器材有限公司 流动相： A-250mM 甲酸铵+0.1%甲酸水溶液；B-乙腈 流速：0.8mL/min 柱温：50℃ 进样体积：10uL 洗针方式：外壁洗针 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为75%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.00 Pumps Pump B Conc. 5 3.00 Pumps Pump B Conc. 5 3.10 Pumps Pump B Conc. 75 5.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式：ESI+ 接口温度：300℃ 雾化气流速：2.5L/min 干燥气流速：10 L/min加热模块温度：500℃ 加热气流速：3L/minDL温度：150℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) MRM参数：见表2 表2 MRM参数 N0. 名称 CAS 号 采集模式 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 卡那霉素 25389-94-0 正 485.85 324.30* -21 -17 -15 163.05 -22 -30 -30 *代表定量离子对。 1.3标准溶液制备 以1%甲酸水配制标准贮备液(1000 ug/mL)， 以75%乙青水(含1%甲酸)逐级稀释为0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL共7个标准系列工作溶液，因氨基糖苷对玻璃瓶有吸附，建议用聚丙烯塑料样品瓶。 1.4样品前处理 准确取 100 uL样品溶液，加入300 uL乙腈，聚丙烯管中涡旋混匀，14000 rpm离心5min， 除蛋白后，上机分析。 结果与讨论 2.1专属性 基质空白与0.5 ng/mL标准溶液 MRM 重叠谱图显示，目标峰保留时间处，未见明显干扰。 图1 基质空白和 0.5 ng/mL对照溶液重叠色谱图 图2 校准曲线 2.2线性关系 按照1.3配制7个不同浓度的标准系列溶液，按照1.2中的分析条件进行测定。以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，外标法绘制校准曲线。各化合物校准曲线见图2，相关系数R大于0.997和，定量限为0.5 ng/mL，信噪比为15.31，准确度范围为 88%-107%。 2.3精密度实验 对标准溶液0.5 ng/mL、连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的精密度结果如图3所示。保留时间 RSD%小于0.4%，峰面积的 RSD 为5.06%，仪器精密度良好。 口<>定量结果视图ID#1 4 卜 卡那霉素 Data# 数据文件名 级别号 保留时间 面积 浓度 (ug/L) 标准浓度 精确度% 统计 1 LOQ-repeat001.lcd 1 1.471 792 0.510 0.5 101.9 2 LOQ-repeat002.lcd 1 1.473 834 0.528 0.5 105.5 3 LOQ-repeat003.lcd 1 1.473 873 0.544 0.5 108.8 4 LOQ-repeat004.lcd 1 1.475 956 0.579 0.5 115.8 5 LOQ-repeat005.lcd 1 1.473 857 0.537 0.5 107.4 6 LOQ-repeat006.lcd 1 1.484 779 0.504 0.5 100.9 平均 1.475 849 0.534 106.7 %RSD 0.314792 7.519816 5.059569 5.057181 最大 1.484 956 0.579 115.8 最小 1.471 779 0.504 100.9 标准偏差 0.004642 63.819737 0.027001 5.396792 图3精密度结果(n=6) 2.4加标回收实验 使用本方法检测了C群脑膜炎球菌多糖结合物原液样品，在阴性样品中添加标准溶液，配制为三个不同浓度的加标样品，每个浓度平行制备三份，按照1.4处理后上机分析，样品检测结果和加标回收结果见表3。三个浓度加标回收率在 90.10~101.50%之间，测试结果的 RSD 在 0.65~2.38%之间，方法可靠。 表3样品加标回收率(n=3) 化合物名称 样品含量 1.0 ng/mL 10ng/mL 80 ng/mL ng/mL 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 卡那霉素 N.D. 90.10 2.38 90.80 0.65 101.50 1.06 注： N.D.表示未检出. 2.5残留考察 高浓度标准样品(100ng/m) 分析完成后，进样分析溶剂空白，分析结果与定量下限 (0.5 ng/mL)比对，残留考察结果表明，卡那霉素定量检测通道中均无干扰，结果见图4。 2.6样品检测 用该方法对A群C群脑膜炎球菌多糖结合物原液平行制备3份样品，均未检测出卡那霉素抗生素残留，结果见图5。 Q485.35>324.20(+) 1.38e2 1图4 残留考察溶剂空白和定量下限 MRM 重叠图 图5 样品检测测 MRM 色谱图 结论 本文建立了一种使用岛津三重四极杆液杆联用仪 LCMS-8045 测定疫苗中卡那霉素抗生素残留的方法。并使用本方法对A群C群脑膜炎球菌多糖结合物原液样品进行检测，并未检出卡那霉素抗生素残留。本方法快速、灵敏、准确，适用于疫苗及生物制品中卡那霉素抗生素的检测和监控。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8045测定疫苗中卡那霉素抗生素残留的方法。并使用本方法对A群C群脑膜炎球菌多糖结合物原液样品进行检测，并未检出卡那霉素抗生素残留。本方法快速、灵敏、准确，适用于疫苗及生物制品中卡那霉素抗生素的检测和监控。